核酸內(nèi)切酶VIII（EndonucleaseVIII）是一種來自大腸桿菌的DNA損傷修復(fù)酶，具有以下特點(diǎn)：1.**雙功能活性**：核酸內(nèi)切酶VIII具有N-糖基化酶(N-glycosylase)活性和AP裂解酶(AP-lyase)活性。2.**釋放受損嘧啶堿基**：N-糖基化酶活性可以釋放雙鏈DNA上受損的嘧啶堿基，如胸腺嘧啶乙二醇和尿嘧啶乙二醇，生成一個(gè)脫嘌呤(apurinic,AP)位點(diǎn)。3.**切割A(yù)P位點(diǎn)**：AP裂解酶活性可以切割A(yù)P位點(diǎn)的3'和5'端，產(chǎn)生一個(gè)具有3'和5'磷酸的堿基缺口(Gap)。4.**識(shí)別并切除受損堿基**：核酸內(nèi)切酶VIII可以識(shí)別并切除多種受損堿基，包括尿素、5,6-二羥基胸腺嘧啶、胸腺嘧啶乙二醇、5-羥基-5-甲內(nèi)酰脲、尿嘧啶乙二醇、6-羥基-5,6-二氫胸腺嘧啶和甲基羥丙二酰脲。5.**與EndonucleaseIII的區(qū)別**：雖然核酸內(nèi)切酶VIII與核酸內(nèi)切酶III相似，但核酸內(nèi)切酶VIII具有β和δ裂解酶活性，而核酸內(nèi)切酶III具有β裂解酶活性。6.**應(yīng)用領(lǐng)域**：核酸內(nèi)切酶VIII可以應(yīng)用于單細(xì)胞凝膠電泳、NGS建庫中DNA損傷修復(fù)、酶法合成DNA中釋放DNA鏈、堿洗脫，搭配尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)進(jìn)行含U片段的克隆等。

牛痘DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I（VacciniaVirusDNATopoisomeraseI）是一種來源于牛痘病毒的I型真核拓?fù)洚悩?gòu)酶，具有以下功能和應(yīng)用：1.**功能**：-牛痘DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I可以催化雙鏈DNA分子中單鏈DNA特定序列位置的磷酸二酯鍵的斷開和連接。-具有解超螺旋的酶(DNARelaxingEnzyme)活性，能夠通過快速的酶切和連接使雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀的正或負(fù)超螺旋DNA發(fā)生解超螺旋，形成含有較少的正或負(fù)超螺旋的雙鏈環(huán)狀DNA分子。-能夠使雙鏈DNA形成繩結(jié)(knotting)或解開繩結(jié)(unknotting)，聯(lián)結(jié)互補(bǔ)的單鏈環(huán)狀DNA成為雙鏈環(huán)狀DNA。2.**應(yīng)用**：-作為一種DNA重組連接的新型工具酶，用于DNA載體和重組片段的連接、缺刻修復(fù)、接頭連接等。-適用于TOPO克隆載體的制備、NGS建庫中的接頭連接等。-在TOPO克隆技術(shù)中，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I同時(shí)具有限制酶和連接酶特性，其生物學(xué)功能是在復(fù)制期間切割并重新連接DNA。3.**使用方法**：-用于DNA快速酶切流程，包括配制體系反應(yīng)液、輕柔混勻、37℃孵育15分鐘等步驟。4.**儲(chǔ)存條件**：-建議在-25～-15℃保存，有效期為3年。5.**注意事項(xiàng)**：-避免起泡或劇烈攪拌、渦旋等操作，以防止酶失活。牛痘DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I因其獨(dú)特的功能，在分子生物學(xué)研究和基因工程中扮演著重要的角色。Recombinant Human Nectin-1/PVRL1/CD111 Protein,His tagCas12a不僅具有順式切割活性，還具備獨(dú)特的反式切割活性，這使得它能夠無差別地裂解附近的單鏈DNA。

不同的DNA聚合酶在PCR中的應(yīng)用差異主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1.**TaqDNAPolymerase**：是常用的DNA聚合酶之一，來源于Thermusaquaticus，具有較高的熱穩(wěn)定性及擴(kuò)增效率。但它缺乏3'-5'核酸外切酶活性，即沒有校正功能，因此其保真性相對(duì)較低。Taq酶適合擴(kuò)增較短的DNA片段（通常不超過3kb），且在PCR產(chǎn)物的3'端帶A堿基，可直接用于TA克隆。2.**PfuDNAPolymerase**：來源于Pyrococcusfuriosus，是一種高保真聚合酶，具有3'-5'外切酶活性，可以修復(fù)并糾正PCR反應(yīng)中的腺嘌呤堿基誤配，有效防止誤差累積。Pfu聚合酶適用于需要高度準(zhǔn)確的PCR擴(kuò)增和DNA測序。3.**VentDNAPolymerase**：來源于Thermuslitoralis，具有中等保真度，比Taq聚合酶高兩倍。它適用于GC含量高或復(fù)雜序列的PCR擴(kuò)增，具有較高的熱穩(wěn)定性，半衰期可達(dá)6.7小時(shí)。4.**KODDNAPolymerase**：來源于Thermococcuskodakaraensis，具有高保真性和高熱穩(wěn)定性，保真性是Taq的約50倍，同時(shí)具有合成速度快的特點(diǎn)，聚合速度約為普通PfuDNAPolymerase的5倍，特別適合于高保真地?cái)U(kuò)增6kb以內(nèi)的PCR產(chǎn)物。

在PCR實(shí)驗(yàn)中，除了BsuDNAPolymerase，還有幾種聚合酶適合高溫?cái)U(kuò)增，包括：1.**TaqDNAPolymerase**：這是常用的PCR聚合酶，來源于Thermusaquaticus，能夠在72°C的比較好活性溫度下工作。它具有良好的熱穩(wěn)定性，可以承受PCR的熱變性步驟，且中途不需要再添加酶。2.**PfuDNAPolymerase**：來源于Pyrococcusfuriosus，具有出色的熱穩(wěn)定性和3'→5'外切酶活性，提供校正功能，適用于對(duì)PCR保真性要求較高的實(shí)驗(yàn)，如基因篩選、克隆表達(dá)、突變檢測、定點(diǎn)突變等。3.**VentDNAPolymerase**：來源于Litoralis棲熱球菌，具有3'→5'外切酶活性，可以去除錯(cuò)配的堿基，具有校對(duì)功能，保真度比TaqDNAPolymerase高5~15倍。4.**KODDNAPolymerase**：來自Thermococcuskodakaraensis，具有高保真性和高熱穩(wěn)定性，保真性比PfuDNAPolymerase更高，優(yōu)化后的PCR反應(yīng)緩沖液能使得其擴(kuò)增速度達(dá)到Taq酶的2倍、Pfu酶的5-6倍。5.**BstDNAPolymerase**：來源于Bacillusstearothermophilus，具有3'到5'外切割活性，適用于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，如LAMP技術(shù)，可在恒溫下進(jìn)行DNA擴(kuò)增，無需繁瑣的溫度循環(huán)。Hifair? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit ：適用于從總RNA或mRNA模板合成鏈cDNA，具有高熱穩(wěn)定性。

為了確保PCR實(shí)驗(yàn)中BstDNAPolymeraseI的活性比較大化，以下是一些關(guān)鍵的優(yōu)化措施：1.**反應(yīng)緩沖液**：使用適合BstDNAPolymeraseI的反應(yīng)緩沖液，如NEB提供的IsothermalAmplificationBufferIIPack，該緩沖液包含Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4和Tween®20，pH值為8.8，專為等溫?cái)U(kuò)增設(shè)計(jì)。2.**反應(yīng)條件**：BstDNAPolymeraseI的比較好反應(yīng)溫度通常在65°C左右。確保PCR儀能夠精確控制并保持這一溫度，以保證酶的活性和穩(wěn)定性。3.**酶的濃度**：根據(jù)反應(yīng)體系的需要調(diào)整BstDNAPolymeraseI的用量。過多的酶可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，而過少則可能降低擴(kuò)增效率。通常，一個(gè)單位的酶能夠在65°C下，30分鐘內(nèi)將25nmol的dNTP摻入酸不溶性物質(zhì)。4.**Mg2+濃度**：Mg2+是DNA聚合酶活性的關(guān)鍵輔因子。其濃度對(duì)PCR反應(yīng)有影響，需要根據(jù)具體情況調(diào)整Mg2+濃度，以獲得比較好的擴(kuò)增效果。5.**dNTPs濃度**：dNTPs是DNA合成的基礎(chǔ)原料，其濃度約為200-300μM較為適宜。過高會(huì)增加非特異性擴(kuò)增。6.**引物設(shè)計(jì)**：設(shè)計(jì)特異性引物，通常長度為18-30個(gè)堿基，Tm（熔解溫度）相近，以保證同時(shí)退火。7.**模板DNA的質(zhì)量和純度**：確保模板DNA無蛋白質(zhì)、RNA和其他雜質(zhì)的污染，這些雜質(zhì)可能會(huì)抑制酶的活性。由于其高活性，pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶允許從極少量的細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如單細(xì)胞水平的研究。Recombinant Human CD7 (His-Avi Tag)

Pfu DNA Polymerase在基因組測序中的應(yīng)用：Pfu DNA Polymerase用于基因組測序，確保測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。Recombinant Mouse GIP Protein,hFc Tag

在PCR實(shí)驗(yàn)中，確保引物與目標(biāo)序列的完全特異性是至關(guān)重要的，這可以通過以下幾個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)：1.**基于已知序列設(shè)計(jì)引物**：根據(jù)目標(biāo)DNA序列，使用計(jì)算機(jī)軟件（如Primer3、Snapgene等）設(shè)計(jì)出兩個(gè)互補(bǔ)的引物，以保證引物的特異性和準(zhǔn)確性。2.**引物長度和Tm值**：通常選擇引物長度為18-25個(gè)核苷酸，引物的Tm值（熔解溫度）通常選擇在50-60℃之間，以保證引物和目標(biāo)DNA序列的穩(wěn)定性。3.**避免與其他DNA序列的交叉反應(yīng)**：使用BLAST等計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行引物特異性檢查，確保引物只與目標(biāo)序列互補(bǔ)，而不與其他非目標(biāo)序列發(fā)生雜交。4.**避免引物自身結(jié)合**：設(shè)計(jì)引物時(shí)要避免引物之間自身結(jié)合，因?yàn)檫@會(huì)影響PCR反應(yīng)的特異性和效率。5.**引物的3'端設(shè)計(jì)**：引物的3'端應(yīng)避免富含GC，以確保與模板序列的穩(wěn)定結(jié)合。同時(shí)，避免3'端存在序列，以防止形成引物二聚體。6.**避免內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)**：設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)避免存在可能產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，以保證引物與模板序列的結(jié)合。7.**使用在線工具進(jìn)行引物特異性檢驗(yàn)**：利用Primer-BLAST等在線工具設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行特異性驗(yàn)證，確保引物只擴(kuò)增特定目標(biāo)序列。Recombinant Mouse GIP Protein,hFc Tag