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美國(guó)布魯克雙光子顯微鏡成像原理是什么

來源: 發(fā)布時(shí)間:2022-01-19

使用雙光子顯微鏡(2PM)可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng);成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng),但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn),但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像,需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,虛擬源越遠(yuǎn),物鏡處的光束尺寸越大,焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,y軸的橫向分辨率為0.35μm。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?美國(guó)布魯克雙光子顯微鏡成像原理是什么

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雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子;其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙(多)光子成像優(yōu)勢(shì)在于,具有更深的組織穿透深度,利用紅外光,能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域;因信號(hào)背景比高,而具有更高的對(duì)比度;因激發(fā)體積小,具有定點(diǎn)激發(fā)的特性,具有更少的光毒性;激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),能夠更加安全。國(guó)外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)雙光子顯微鏡的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子。

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從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn):☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,這一波段的光對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小,適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究;☆穿透能力強(qiáng):相對(duì)于紫外光,可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,因而受生物組織散射的影響更小,解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題;☆高分辨率:由于雙光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi);☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象;☆熒光收集率高:與共聚焦成像相比,雙光子成像不需要光學(xué)濾波器(共焦),這樣就提高了對(duì)熒光的收集率,而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高;☆圖像對(duì)比度高:由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng),因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16,降低了散射的干擾;☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性,所以可以對(duì)生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究;

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國(guó)家重大科研儀器研制專項(xiàng)的一個(gè)碩果。它彰顯了北京大學(xué)在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域先期布局的前瞻性,鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學(xué)科交叉背景和重要技術(shù)創(chuàng)新能力的“中國(guó)智造”隊(duì)伍。目前,該研發(fā)團(tuán)隊(duì)正在領(lǐng)銜建設(shè)“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學(xué)成像”十三五國(guó)家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施,積極參與即將啟動(dòng)的中國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃。可以期待,微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實(shí)現(xiàn)“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰(zhàn)略目標(biāo)發(fā)揮不可或缺的重要作用雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。

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雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?生物組織在近紅外波段存在兩個(gè)窗口,第1個(gè)近紅外窗口對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)在700nm-900nm,第2個(gè)近紅外窗口對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)在1000nm-1400nm之間。舉例說明就是單晶硅對(duì)于可見光幾乎是不透明的,但是對(duì)于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了。原因有兩點(diǎn):1.生物組織對(duì)紅外光的吸收弱,對(duì)可見光吸收強(qiáng)。類似的,平時(shí)用手電筒照射手指,會(huì)看到手通透紅亮,也是由于生物組織對(duì)長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光吸收少。2.生物組織對(duì)紅外光的散射弱。因?yàn)槿鹄⑸涞膹?qiáng)度反比于波長(zhǎng)λ的四次方。類似的,早晨的太陽(yáng)非常紅,也就是因?yàn)殚L(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光穿透力更強(qiáng)。這兩點(diǎn)共同導(dǎo)致長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅外光比可見光對(duì)生物組織的穿透能力強(qiáng)。雙光子顯微鏡使用方法是什么?美國(guó)激光雙光子顯微鏡光損傷

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實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評(píng)估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率,并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對(duì)比,實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長(zhǎng)為521 nm,使用放大倍率為100倍的物鏡,尺寸為0.6AU,對(duì)直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測(cè)試性成像,共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm,這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,軸向的半高寬較1PE減少,可以提高空間分辨率。美國(guó)布魯克雙光子顯微鏡成像原理是什么