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美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡原理

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-08-16

當(dāng)細(xì)胞在受到外界刺激時(shí),隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng),即使刺激繼續(xù)存在,Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng),反而會(huì)減弱,直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過(guò)程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況,研究發(fā)現(xiàn),配了在粘著過(guò)程中,Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化,而配子之間發(fā)生融合作用時(shí),Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值,并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象,對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過(guò)程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過(guò)程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等,Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很的變化。多光子顯微鏡的大多數(shù)補(bǔ)償器都采用棱鏡。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡原理

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多光子激發(fā)的特點(diǎn)。激發(fā)波長(zhǎng)∶兩個(gè)或多個(gè)光子同時(shí)激發(fā),激發(fā)波長(zhǎng)是單光子激發(fā)波長(zhǎng)的兩倍或多倍(i.e.紅光能激發(fā)UV探針)。多光子激發(fā)∶依賴(lài)于多個(gè)光子同時(shí)到達(dá)的時(shí)間。使用脈沖飛秒激光器(i.e.10-16seconds),且能提供更高的峰值功率。熒光限制在焦點(diǎn)處,能滿(mǎn)足多個(gè)光子同時(shí)達(dá)到產(chǎn)生多光子吸收。熒光強(qiáng)度正比于(激光強(qiáng)度)n。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器,皮秒脈沖不能實(shí)現(xiàn)三光子激發(fā)。深度成像需要更高、更窄脈沖輸出功率。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū),對(duì)細(xì)胞毒性和光漂白更小。美國(guó)全自動(dòng)多光子顯微鏡系統(tǒng)世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國(guó)和日本,德國(guó)是徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司。

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1,光源、光路高度整合通過(guò)精密的設(shè)計(jì),將飛秒激光器、掃描振鏡、PMT、濾光片組,甚至是單光子熒光光路全套整合在一個(gè)不大的掃描頭內(nèi),無(wú)論掃描頭如何移動(dòng),掃描頭內(nèi)的光路都可以保持穩(wěn)定不變,從而實(shí)現(xiàn)了超穩(wěn)定、免維護(hù)的特點(diǎn)。2,配合多維度、高精度機(jī)械控制系統(tǒng)。掃描頭直接架設(shè)在一個(gè)多維運(yùn)動(dòng)的機(jī)械裝置上,可沿任意方向和角度移動(dòng)掃描頭,方便對(duì)動(dòng)物樣本進(jìn)行多方位的掃描觀察。而這在常規(guī)方案的多光子顯微鏡上有很大的實(shí)現(xiàn)難度,不但需要多個(gè)關(guān)節(jié)組合的光路導(dǎo)向機(jī)構(gòu),并且在這些關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)的時(shí)候,都冒著極大的光路偏移的風(fēng)險(xiǎn),以至于在使用一段時(shí)間后都需要對(duì)光路進(jìn)行再次校準(zhǔn),而這樣的問(wèn)題在我司上則完全不會(huì)發(fā)生。3.一機(jī)多能。

某種物質(zhì)能產(chǎn)生熒光,首要條件是分子必須具有吸收的結(jié)構(gòu),即生色團(tuán)(分子中具有吸收特征頻率的光能的基團(tuán))。其次,該物質(zhì)必須具有一定的量子產(chǎn)率和適宣的環(huán)境。我們把分子中發(fā)射熒光的基團(tuán)稱(chēng)為熒光團(tuán)。熒光團(tuán)一定是生色團(tuán),但生色團(tuán)不一定是熒光團(tuán)。因?yàn)?,如果生色團(tuán)的量子產(chǎn)率等于零,就不能發(fā)射出熒光,處于激發(fā)態(tài)的分子,可以由許多方式(如熱,碰撞)把能量釋放出來(lái),發(fā)射熒光只是其中的一種方式。此外,一種物質(zhì)吸收光的能力及量子產(chǎn)率又與物質(zhì)所處的環(huán)境密切相關(guān)。多光子顯微鏡是一款針對(duì)厚樣本進(jìn)行深層成像的利器,特別是在實(shí)驗(yàn)中。

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有許多方法可以實(shí)現(xiàn)快速光柵掃描,例如使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描,以及將振鏡與可調(diào)電動(dòng)透鏡相結(jié)合進(jìn)行快速3D掃描。而可調(diào)電動(dòng)式鏡頭由于機(jī)械慣性的限制,無(wú)法在軸向快速切換焦點(diǎn),影響成像速度?,F(xiàn)在它可以被空間光調(diào)制器(SLM)取代。遠(yuǎn)程對(duì)焦也是實(shí)現(xiàn)3D成像的一種手段,如圖2所示。LSU模塊中,掃描振鏡水平掃描,ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,通過(guò)調(diào)整M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,還可以進(jìn)行快速軸向掃描。為了獲得更多的神經(jīng)元成像,可以通過(guò)調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來(lái)放大FOV。然而,大NA和大FOV的物鏡通常很重,不能快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描,因此大FOV系統(tǒng)依賴(lài)于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。多光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用,可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)分布、細(xì)胞活動(dòng)等。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡原理

由于多光子激發(fā)的發(fā)生概率較低,因此需要使用高功率的激光束來(lái)增加激發(fā)的幾率。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡原理

多光子激光掃描顯微鏡的產(chǎn)業(yè)發(fā)展,世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要分布在德國(guó)和日本,德國(guó)以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為基礎(chǔ),日本以尼康和奧林巴斯為基礎(chǔ)。2020年以來(lái),這些企業(yè)占據(jù)了全球多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的64.44%,它們的發(fā)展策略影響著多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的走向。目前,世界市場(chǎng)對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求正在增長(zhǎng),中國(guó)市場(chǎng)的需求增長(zhǎng)更快。未來(lái)五年多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的發(fā)展在中國(guó)將仍有巨大的發(fā)展?jié)摿?。美?guó)共聚焦多光子顯微鏡原理