而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級同時(shí)放出一個(gè)波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，從而被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，使其能夠更加安全。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡供應(yīng)商對于顯微成像技術(shù)包含：寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。

雙光子顯微鏡是一種先進(jìn)的成像技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞或組織的深層觀察。它的主要特點(diǎn)是使用雙光子激發(fā)來產(chǎn)生熒光，從而實(shí)現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性，將高能激光束聚焦到生物樣品中，激發(fā)出熒光。這個(gè)過程需要使用一個(gè)特殊的雙光子激發(fā)源，它能夠?qū)⒁粋€(gè)光子轉(zhuǎn)換為兩個(gè)光子，其中一個(gè)光子用于激發(fā)熒光，另一個(gè)光子則用于成像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點(diǎn)：高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性，可以實(shí)現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像，特別是對于深層組織的觀察。穿透深度大：雙光子激光的波長較長，能夠更好地穿透生物組織，從而實(shí)現(xiàn)對深層細(xì)胞的觀察。熒光壽命長：雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命比單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命長，這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區(qū)分不同的熒光標(biāo)記物。減少光毒性：由于雙光子激發(fā)的能量較低，因此對生物樣品的損傷較小，可以減少光毒性。總之，雙光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術(shù)，可以用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究。

美國霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所在JaneliaFarmResearchCampus的吉娜博士小組與來自中科院上海光機(jī)所強(qiáng)場激光物理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的王琛博士較近成功將一種新的自適應(yīng)光學(xué)的方法和雙光子顯微鏡結(jié)合，研制出一種新的自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡。通過校正小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號強(qiáng)度，明顯改進(jìn)了成像質(zhì)量，使得原來在鼠腦中不可見或者模糊的細(xì)節(jié)變得清晰可見，她們成功將該方法應(yīng)用于老鼠視覺皮層第五層（約500μm）的形貌結(jié)構(gòu)成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應(yīng)光學(xué)方法，使得在小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實(shí)。這一成果發(fā)表在較新一期的《NatureMethods》。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。

指示劑是如何負(fù)載細(xì)胞，目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法，且都可以用于體內(nèi)和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個(gè)神經(jīng)元中。此方法方便實(shí)驗(yàn)者控制單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負(fù)載神經(jīng)元，觀察對象為一群神經(jīng)元。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細(xì)胞也被指示劑所標(biāo)記，但明顯提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動作電位相關(guān)性的活動。第三種也較為常用，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。（A）單細(xì)胞注射法；（B）networkloading法；（C）通過病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。國內(nèi)2PPLUS雙光子顯微鏡掃描深度

用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重?zé)ㄐ律?PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)？因?yàn)榻M織對可見光區(qū)域的較強(qiáng)吸收和散射帶來兩個(gè)嚴(yán)重的問題第1個(gè)是激發(fā)光的減弱，第2個(gè)就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性，單光子激發(fā)的背景較強(qiáng)，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率因?yàn)榻M織對可見光區(qū)域的較強(qiáng)吸收和散射帶來兩個(gè)嚴(yán)重的問題第1個(gè)是激發(fā)光的減弱，第2個(gè)就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性，單光子激發(fā)的背景較強(qiáng)，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率剛好雙光子在這兩點(diǎn)具有很大的優(yōu)勢上面的內(nèi)容基本在談到雙光子優(yōu)勢都會相對說明，在實(shí)際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料，已經(jīng)有做到mm級別的穿透深度2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)