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進口腦片膜片鉗細胞功能特性

來源: 發(fā)布時間:2023-03-02

1976年德國馬普生物物理化學研究所Neher和Sakmann在青蛙肌細胞上用雙電極鉗制膜電位的同時,記錄到ACh的單通道離子電流,從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。1980年Sigworth等在記錄電極內(nèi)施加5-50cmH2O的負壓吸引,得到10-100GΩ的高阻封接(Giga-seal),明顯降低了記錄時的噪聲實現(xiàn)了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破。1981年Hamill和Neher等對該技術(shù)進行了改進,引進了膜片游離技術(shù)和全細胞記錄技術(shù),從而使該技術(shù)更趨完善,具有1pA的電流靈敏度、1μm的空間分辨率和10μs的時間分辨率。1983年10月,《Single-ChannelRecording》一書問世,奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻,榮獲1991年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。Neher將膜片鉗技術(shù)與Fura 2 熒光測鈣技術(shù)結(jié)合。進口腦片膜片鉗細胞功能特性

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膜片鉗放大器的工作模式;(1)電壓鉗模式∶在鉗制細胞膜電位的基礎上改變膜電位,記錄離子通道電流的變化,記錄的是諸如通道電流;EPSC;IPSC等電流信號。是膜片鉗的基本工作模式.(2)屯流鉗素向細胞內(nèi)注入刺激電流,記錄膜電位對刺激電流的反應。記錄的是諸如動作電位,EPSP;IPSP等電壓信號。膜片鉗技術(shù)實現(xiàn)膜電位固定的關鍵是在玻璃微電極前列邊緣與細胞膜之間形成高阻(10GΩ)密封,使電極前列開口處相接的細胞膜片與周圍環(huán)境在電學上隔離,并通過外加命令電壓鉗制膜電位。美國多通道膜片鉗實驗操作對離子通道功能的研究,主要采用記錄離子通道電流來間接反映離子通道功能。

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膜片鉗技術(shù)的建立1.拋光及填充好玻璃管微電極,并將它固定在電極夾持器中。2.通過一個與電極夾持器連接的導管給微電極內(nèi)一個壓力,一直到電極浸入記錄槽溶液中。3.當電極浸沒在溶液中時給電極一個測定脈沖(命令電壓,如5-10ms,10mV)讀出電流,按照歐姆定律計算電阻。4.通過膜片鉗放大器的控制鍵將微電極前列的連接電位(junctionpotentials)調(diào)至零位,這種電位差是由于電極內(nèi)填充溶液與浸浴液不同離子成分的遷移造成的。5.用微操縱器將微電極前列在直視下靠近要記錄的細胞表面,并觀察電流的變化,直至阻抗達到1GΩ以上形成"干兆封接"6.調(diào)整靜息膜電位到期望的鉗位電壓的水平,使放大器從"搜尋"轉(zhuǎn)到"電壓鉗"時細胞不至于鉗位到零。

實驗溶液浸溶細胞溶液和微電極玻璃管內(nèi)的填充液成分對全細胞膜片鉗記錄也是很重要的內(nèi)容,這關系到封接的容易程度、細胞存活狀態(tài)及膜電位的狀態(tài)等。在實驗記錄過程中,尤其是神經(jīng)生物學實驗,需要迅速更換細胞浸溶液濃度以免受體敏感性降低(desensitization)或需要模擬快速突觸反應的壽命。原則上細胞的浸溶液成分或玻璃管內(nèi)填充液成分應該與細胞外或細胞內(nèi)間質(zhì)的成分相似,實際研究中,為了探討某些通道或電位特性,對這些實驗溶液的成分或濃度會作必要調(diào)整,沒有哪種溶液是理想的?,F(xiàn)代膜片鉗技術(shù)是在電壓鉗技術(shù)的基礎上發(fā)展起來的。

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離子選擇性(selectivity)(大小和電荷)∶某一種離子只能通過與其相應的通道跨膜擴散(安靜∶K>Na100倍、興奮;Na>K10-20倍);各離子通道在不同狀態(tài)下,對相應離子的通透性不同。門控特性(Gating)∶失活狀態(tài)不僅是通道處于關閉狀態(tài),而且只有在經(jīng)過一個額外刺激使通道從失活關閉狀態(tài)進入靜息關閉狀態(tài)后,通道才能再度接受外界刺激而***開放。離子通道的功能(FunctionoflonChannels)1.產(chǎn)生細胞生物電現(xiàn)象,與細胞興奮性相關。2.神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、腺體的分泌、肌肉的運動、學習和記憶3.維持細胞正常形態(tài)和功能完整性膜離子通道的基因變異及功能障礙與許多疾病有關,某些先天性與后天獲得性疾病是離子通道基因缺陷與功能改變的結(jié)果,稱為離子通道病(ionchannelpathies)。膜電導測定的依據(jù)是電學中的歐姆定律。雙分子層膜片鉗蛋白質(zhì)分子水平

膜片鉗80%的工夫在于刺備細胞。進口腦片膜片鉗細胞功能特性

資料分析:一般電學性質(zhì)∶通過I/V關系計算得到單通道電導,觀察通道有無整流。通過離子選擇性、翻轉(zhuǎn)電位或其它通道的條件初步確定通道類型。通道動力學分析∶開放時間、開放概率、關閉時間、通道的時間依賴性失活、開放與關閉類型(簇狀猝發(fā),Burst)樣開放與閃動樣短暫關閉(flickering),化學門控性通道的開、關速率常數(shù)等數(shù)據(jù)。藥理學研究∶研究的藥物,阻斷劑、激動劑或其它調(diào)制因素對通道活動的影響情況。綜合分析得出結(jié)淪。進口腦片膜片鉗細胞功能特性

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