所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法?！eal-timePCR是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)主要特點(diǎn)：精確定量、快速高效、小巧輕便。湛江熒光定量qPCR儀應(yīng)用

傳統(tǒng)定量PCR方法簡(jiǎn)介：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以?xún)?nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。2）競(jìng)爭(zhēng)法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。上海高效qPCR儀消毒SYBR Green是一種DNA插入染料用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針?lè)椒ū阋?，但是特異性沒(méi)有熒光探針?lè)椒ê谩?/p>

合成引物時(shí)需注意：在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，首先確定要擴(kuò)增的DNA區(qū)域，并設(shè)計(jì)一對(duì)專(zhuān)門(mén)位于目標(biāo)區(qū)域的引物，一個(gè)在正向鏈上，另一個(gè)在反向鏈上。引物須具有特異性，避免擴(kuò)增出非特異性片段。正向引物與反向引物應(yīng)具有相似的退火溫度，GC含量與退火溫度相關(guān)，調(diào)整引物長(zhǎng)度可以改變退火溫度。避免引物序列有二級(jí)結(jié)構(gòu)或引物二聚體，會(huì)降低PCR效率。許多的在線工具可用于輔助引物設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增包括三組被設(shè)定好的時(shí)間和溫度，步驟為：變性，退火和延伸1、變性：PCR的第一步稱(chēng)為變性，將模板DNA加熱到95°C幾秒鐘，將兩條DNA鏈分開(kāi)，使它們之間的氫鍵迅速斷裂。2、退火：反應(yīng)混合物冷卻30秒至1分鐘。退火溫度通常為50-65°C，但確切的比較好溫度取決于引物的長(zhǎng)度和順序。不同的引物可能具有不同的退火溫度。3、延伸：溫度升至混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作溫度，通常約為72°C。DNA聚合酶附著在每個(gè)引物的一端，并合成與模板DNA互補(bǔ)的DNA新鏈。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。qPCR只能實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量，即必須使用標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，才能進(jìn)行定量。

TaqMan qPCR：該測(cè)定不使用嵌入染料，而是使用帶有 5' 熒光報(bào)告染料和 3' 淬滅染料的 TaqMan 探針。 這些探針是目標(biāo)特異性的，并且在退火步驟中與引物之一下游的目標(biāo) DNA 序列結(jié)合。 當(dāng) Taq 聚合酶在延伸階段遇到 TaqMan 探針時(shí)，它會(huì)置換并切割 5' 報(bào)告染料。 一旦報(bào)告染料與淬滅染料分離，其在每個(gè) qPCR 循環(huán)結(jié)束時(shí)的可測(cè)量熒光信號(hào)就會(huì)顯著增加。 第二條 DNA 鏈?zhǔn)瞧叫泻铣傻?，但由于沒(méi)有探針附著在它上面，因此無(wú)法通過(guò)熒光測(cè)量來(lái)監(jiān)測(cè)這一過(guò)程。與 SYBR Green 檢測(cè)相比，使用 TaqMan 探針的成本更高，但也具有兩個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)：TaqMan 檢測(cè)測(cè)量目標(biāo)序列的擴(kuò)增進(jìn)程，因?yàn)樘结樖悄繕?biāo)特異性的。您可以通過(guò)向主混合物中添加不同的引物和具有不同報(bào)告染料的 TaqMan 探針來(lái)監(jiān)測(cè)單個(gè)反應(yīng)中各種 qPCR 產(chǎn)物的數(shù)量。 這種多重方法允許您在每個(gè)熱循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)多個(gè)熒光信號(hào)。qPCR面對(duì)小的差異較弱，dPCR則可識(shí)別差異較小的拷貝數(shù)。珠海Quantagene q225qPCR儀消毒

利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性比較好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)。湛江熒光定量qPCR儀應(yīng)用

qpcr的檢測(cè)原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實(shí)時(shí)積累的熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。qPCR 主要是依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對(duì)定量的方法。隨著PCR的循環(huán)進(jìn)行，染料熒光強(qiáng)度增加，從而檢測(cè)到定量反應(yīng)的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針?lè)椒ū阋耍翘禺愋詻](méi)有熒光探針?lè)椒ê?。湛江熒光定量qPCR儀應(yīng)用

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