Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)主要特點：精確定量 以可靠的數(shù)據(jù)助力您的研究。采用擬合算法計算 Ct 值，定量誤差不超過±10%。液體冷卻循環(huán)系統(tǒng)確?？组g溫度高度一致，溫差不超過 ±0.15°C。光學系統(tǒng)無運動部件，穩(wěn)定性增加，長期使用無需校準與維護。的儀器間重復性，不同位置、不同反應體積均不影響定量結(jié)果。快速高效 用更短的時間獲得更多數(shù)據(jù)。40 個循環(huán)的常規(guī) qPCR 只需43 分鐘，較常見qPCR 儀多縮短60% 的時間。在提高速度的同時保持了96 孔的高通量，滿足絕大多數(shù)實驗需求。小巧輕便 節(jié)省空間及您的寶貴樣品小體積為移動實驗和大量部署提供可能。5-10 μl 的推薦反應體積，較常規(guī)實驗節(jié)省80%的試劑用量，更節(jié)約您的珍貴樣品。定量檢測是一種實時的PCR (qPCR) 檢測。測量（定量）每輪PCR擴增循環(huán)中，檢測目標核酸片段的量。準確qPCR儀采購

1996年，美國ABI公司（現(xiàn)已并入ThermoFisher公司）推出首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，通過熒光定量PCR儀器實時接收擴增過程中熒光染料（或基團）釋放的信號，對反應進行實時監(jiān)控，進而產(chǎn)生相應的擴增曲線。在qPCR反應中，每個循環(huán)結(jié)束熒光染料（或基團）都會釋放相應的熒光信號，這些信號與qPCR產(chǎn)物量成正比。qPCR擴增的階段，分為擴增早期、指數(shù)期和平臺期。在擴增早期，產(chǎn)物量很少，機器接收的熒光信號微弱可能會被覆蓋；產(chǎn)物量逐漸增多反應進入qPCR指數(shù)擴增期，這個階段可以通過指數(shù)期的某個點來對產(chǎn)物進行定量和計算起始的模板量；在擴增平臺期，產(chǎn)物達到一定量，同時熒光信號趨于穩(wěn)定。在qPCR反應中，可以通過不同循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct）區(qū)分擴增信號和背景信號，通過調(diào)節(jié)閾值實現(xiàn)定性和定量分析。靈敏度qPCR儀材質(zhì)實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度。

利用SYBR Green I可以檢測PCR反應中獲得的全部雙鏈DNA,但是不能區(qū)分不同的雙鏈DNA。為了進一步確保熒光檢測的就是靶DNA序列，人們又設計了能與目的DNA序列特異結(jié)合的熒光探針，如TaqMan探針。TaqMan探針是一小段被設計成可以與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA（一般為50-150 bp）,并且該單鏈DNA的5'和3'端帶有短波長和長波長兩個不同熒光基團。這兩個熒光基團由于距離過近，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作用下發(fā)生熒光淬滅，因而檢測不到熒光。PCR反應開始后，隨著雙鏈DNA變性產(chǎn)生單鏈DNA，TaqMan探針結(jié)合到與之配對的靶DNA序列上，并被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐個切除而降解，從而解除熒光淬滅的束縛，熒光基團在激發(fā)光下發(fā)岀熒光，所產(chǎn)生的熒光強度直接反映了被擴增的靶DNA總量。

qPCR擴增效率100%的理想條件下的PCR反應，PCR產(chǎn)物量呈指數(shù)倍增長Yn=Y0×2^n（X0：初始模板量，n：PCR循環(huán)次數(shù)，Yn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量）而實際PCR擴增時可能存在模板質(zhì)量不佳引起的PCR擴增抑制，DNA聚合酶的種類及活性影響，非特異性擴增產(chǎn)物的競爭等情況，擴增效率無法達到100%。擴增初期，PCR產(chǎn)物指數(shù)倍增加，隨著PCR產(chǎn)物的累積，各種影響因素的疊加，PCR產(chǎn)物不再指數(shù)倍增加，每個循環(huán)后產(chǎn)物增加量恒定，進入線性增長期，dNTP消耗殆盡，酶逐漸失活，擴增“停滯”，產(chǎn)物量恒定，進入平臺期。非理想條件下的PCR反應：PCR產(chǎn)物量Yn=Y0(1+Ex)^n（Ex：擴增效率）。dPCR可用于常規(guī)qPCR所需的標準品定量，具有計量學意義 。

PCR反應需要五種關鍵試劑：PCR模板：也稱為模板DNA，需要常規(guī)的試劑盒進行提取。如基因組DNA（gDNA），cDNA和質(zhì)粒DNA。DNA聚合酶：所有PCR反應都需要可在高溫下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是一種常用的酶，它可以在70°C時以60個堿基/秒的速率整合核苷酸，并可以擴增高達5kb的模板，使其適用于無特殊要求的標準PCR。引物：DNA聚合酶需要短序列的核苷酸，以指示它們需要在哪里開始擴增。在PCR中，這些序列稱為引物，是單鏈DNA的短片段（約15-30個堿基）。脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：是合成DNA新鏈的基礎，包括四個基本DNA核苷酸（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）。PCR緩沖液：PCR緩沖液可確保在整個PCR反應過程中保持比較好條件。PCR緩沖液的主要成分包括氯化鎂（MGCl2，充當DNA聚合酶的輔助因子），tris-HCl和氯化鉀（在反應過程中保持穩(wěn)定的pH值）。目前市面上已經(jīng)有很多成熟的包含PCR緩沖液的Taq聚合酶。根據(jù)qPCR擴增曲線整體趨勢，整個擴增過程主要分為四個時期，基線期、指數(shù)增長期、線性增長期和平臺期。準確qPCR儀采購

由于qPCR的高靈敏性，陰性對照有出現(xiàn)擴增信號的情況，那么在針對這類問題時，我們需要判斷其原因所在。準確qPCR儀采購

制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化現(xiàn)在含有目標蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時可以停止ChIP。經(jīng)過解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。定量DNA——測定目標蛋白質(zhì)-DNA水平在該步驟中，通過qPCR定量純化的DNA產(chǎn)物，通過qPCR，您可以確定目標蛋白是否存在于特定位點。ChIP的qPCR如何定量分析ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)需要針對可變性來源進行標準化，包括染色質(zhì)數(shù)量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率。兩種常用的標準化 ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)方法——Percent Input法和富集倍數(shù)法（Fold Enrichmen）。與input相關的ChIP-qPCR數(shù)據(jù)包括ChIP的背景水平和input染色質(zhì)的標準化。建議ChIP 實驗重復，盡可能將結(jié)果與背景信號和標準誤差一起顯示。準確qPCR儀采購

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