基于數(shù)字PCR技術(shù)平臺,塔歌生物成功地開發(fā)了胎兒染色體非整倍體(T21,T18和T13)無創(chuàng)產(chǎn)前篩查試劑盒(數(shù)字PCR-NIPT),并已完成數(shù)百例臨床樣本驗證。數(shù)字PCR-NIPT的陽性檢出率和NGS相似,且成本接近血清學(xué),可以在上述應(yīng)急策略中取代血清學(xué)作為靈敏度和特異性更高的初篩方法,以有效提高陽性檢出率,降低需要復(fù)篩的假陽性樣本數(shù)和節(jié)省總的篩查成本。數(shù)字PCR應(yīng)用前景廣闊,可用于病原微生物檢測、基因檢測、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、測序結(jié)果驗證等領(lǐng)域。但目前,大多數(shù)醫(yī)院采購的數(shù)字PCR儀器是用于科研層面,在臨床應(yīng)用上仍處于起步階段,未得到普遍應(yīng)用。dPCR被稱作第三代PCR技術(shù),但dPCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用逐漸顯現(xiàn)出一些不足之處。廣州數(shù)字PCR試劑盒
數(shù)字PCR是一種核酸分子定量技術(shù)。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法,光度法基于核酸分子的吸光度來定量;實時熒光定量PCR(RealTimePCR)基于Ct值,Ct值就是指可以檢測到熒光值對應(yīng)的循環(huán)數(shù);數(shù)字PCR是的定量技術(shù),基于單分子PCR方法來進(jìn)行計數(shù)的核酸定量,是一種定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法,將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中,每個反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后,有一個核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號,沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積,就可以推算出原始溶液的核酸濃度。廣州數(shù)字PCR試劑盒無創(chuàng)產(chǎn)前篩查有望成為數(shù)字PCR在臨床快速落地的應(yīng)用。
在PCR進(jìn)行的過程中,首先是引物和探針分別結(jié)合,然后開始擴(kuò)增。如果一個微滴當(dāng)中有目標(biāo)基因的片段,Taqman探針就會被酶切碎,熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離。在后面的檢測過程中,熒光基團(tuán)被激發(fā)光路激發(fā)之后就會發(fā)熒光。如果沒有,Taqman探針就不會被切碎,在后面的檢測過程中,熒光基團(tuán)吸收到激發(fā)光的能量,就會被淬滅基團(tuán)給淬滅,那么儀器就檢測不到這個微滴的信號。檢測的過程中,并不是說一個樣本中檢測到了幾個亮點(diǎn),這個反應(yīng)當(dāng)中就有幾個目標(biāo)基因的拷貝。因為目標(biāo)基因的片段,在微滴當(dāng)中的分布,是符合泊松分布的(也就是說進(jìn)不進(jìn)的概率相等,并且相互獨(dú)立)。所以,一個發(fā)光的微滴中,可能有一個或者三個四個,甚至更多個目標(biāo)基因的拷貝。因此,發(fā)光的微滴數(shù)與原始的基因拷貝數(shù)并不是一對一的對應(yīng)關(guān)系。
PCR已成為分子診斷領(lǐng)域重要的技術(shù)手段之一,占據(jù)分子診斷市場的半壁江山。數(shù)字PCR是一代PCR技術(shù),也是當(dāng)前靈敏度和定量精度比較高的分子檢測技術(shù)。但數(shù)字PCR使用成本仍然相對較高,檢測靶點(diǎn)數(shù)少(一般≤6靶點(diǎn)/反應(yīng)),阻礙了其在臨床中的大規(guī)模應(yīng)用,提高數(shù)字PCR的多重檢測能力迫在眉睫?;跓晒馔ǖ罃?shù)的增加和基于探針濃度梯度增加,均可以在一定程度上提高數(shù)字PCR檢測重數(shù),然而只能達(dá)到"線性"增加的目的?;谔结槤舛忍荻鹊亩嘀貦z測技術(shù)雖然光'f明顯增加多重能力,但由于無法避免交叉反應(yīng)現(xiàn)象,不能確保獲得位點(diǎn)特異性的分簇,因此穩(wěn)定性不足、靈敏度較差,難以滿足臨床級別的數(shù)據(jù)要求。而基于創(chuàng)新的且數(shù)字PCR獨(dú)特適用的熒光編碼技術(shù)可以實現(xiàn)“指數(shù)”級的多重檢測,顛覆性的提高數(shù)字PCR檢測重數(shù),覆蓋臨床應(yīng)用多場景需求。楊雁峰博士堅信數(shù)字PCR是可以應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前篩查的理想技術(shù)之一,這也是他2016年創(chuàng)立塔歌生物的初衷。
數(shù)字PCR技術(shù)流分類目前,dPCR的基本方法都已經(jīng)建立,根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式,主要可分為微板式、微腔式和和微滴式三大類系統(tǒng)。微液滴制備的方法,目前主流的有四種:1)芯片微孔物理分割法,俗稱物理分隔法,公司有Fluidgm,Qiagen,Roche,ThermoFisher,;2)液滴分割法,俗稱油包水,代替公司有Bio-Rad;3)雜交式芯片液滴法,公司有Stilla;4)注射振動制滴法。PS:芯片式物理分割技術(shù)所有已經(jīng)過期,目前有不少公司在這個技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行開發(fā),例如羅氏。20世紀(jì)末,Bert Vogelstein等提出數(shù)字PCR的概念。德國賽默飛數(shù)字PCR熒光通道
臻準(zhǔn)推出新款數(shù)字PCR產(chǎn)品:AccuONE2.0數(shù)字PCR系統(tǒng)。廣州數(shù)字PCR試劑盒
在定量PCR時,我們常常糾結(jié)一個問題,究竟是相對定量還是***定量呢?如今,你無需糾結(jié)了,因為數(shù)字PCR(digitalPCR)來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似,都是估計起始樣品中的核酸量,但它們有一個重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測定核酸量,而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù),是對起始樣品的***定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域:拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達(dá)研究(如等位基因不平衡表達(dá))、二代測序結(jié)果驗證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。廣州數(shù)字PCR試劑盒
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