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杭州細(xì)胞培養(yǎng)支原體檢測(cè)方法恒溫?cái)U(kuò)增

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-06-23

支原體污染和黑膠蟲污染是兩種不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)污染,它們具有各自的特點(diǎn)和區(qū)別:
支原體污染:在相差顯微鏡下,支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。
黑膠蟲污染:在高倍鏡下,被黑膠蟲污染的細(xì)胞膜會(huì)變得模糊不清,邊界不清晰,有粗糙感。

污染的影響:
支原體污染:可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖緩慢,甚至從培養(yǎng)器皿脫落,影響細(xì)胞的DNA、RNA及蛋白表達(dá)。
黑膠蟲污染:與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng),開始時(shí)對(duì)細(xì)胞沒有什么影響,但當(dāng)數(shù)量多時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)受到影響直至死亡。

污染的來源:
支原體污染:可能來源于工作環(huán)境的污染、操作者本身、培養(yǎng)基的污染、交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染以及用來制備細(xì)胞的原始組織或部位的污染。
黑膠蟲污染:可能來源于細(xì)胞本身的污染或從動(dòng)物取材時(shí)的污染,也可能通過培養(yǎng)箱空氣進(jìn)行污染。
細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體污染怎么預(yù)防?杭州細(xì)胞培養(yǎng)支原體檢測(cè)方法恒溫?cái)U(kuò)增

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支原體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法需要考慮以下幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn):
1. 樣本的采集與處理:確保樣本的采集和處理過程符合無菌操作規(guī)范,避免交叉污染。
2. 實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化:制定詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作流程,包括樣本接種、培養(yǎng)條件、觀察時(shí)間點(diǎn)等,以保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。
3. 使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基:根據(jù)支原體的特性選擇合適的培養(yǎng)基,如支原體肉湯4. 培養(yǎng)基、精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基等,并確保培養(yǎng)基的靈敏度和特異性。
5. 設(shè)置對(duì)照組:實(shí)驗(yàn)中應(yīng)包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照,以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的有效性和排除假陽性或假陰性結(jié)果。
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LAMP法,即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification),是一種在恒定溫度下進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法。它由日本學(xué)者Notomi于2000年開發(fā)。LAMP法檢測(cè)有以下特性:
快速高效:LAMP技術(shù)可以在1小時(shí)內(nèi)把幾拷貝的目的序列迅速擴(kuò)增到10^9^~10^10^拷貝,擴(kuò)增效率高。
簡(jiǎn)便性:LAMP技術(shù)不需要進(jìn)行模板的預(yù)變性,減少了PCR技術(shù)升降溫帶來的影響以及對(duì)昂貴、精密實(shí)驗(yàn)儀器的要求,同時(shí)擴(kuò)增效率高,可以在較短時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)。
LAMP法因其快速、高效、特異、靈敏和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)應(yīng)用于病原菌、寄生蟲、病毒、疾病和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)等領(lǐng)域,并且還將廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食源安全等領(lǐng)域,具有更為廣闊的發(fā)展應(yīng)用前景。

細(xì)胞培養(yǎng)中支原體難以徹底消滅的原因主要包括以下幾點(diǎn):
1. 無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu):支原體是沒有細(xì)胞壁的微生物,這使得許多作用于細(xì)胞壁的抗*素對(duì)支原體無效。
2. 微小體積:支原體體積小,能夠穿過常規(guī)的除菌濾膜,例如0.20微米甚至0.10微米的濾膜。
3. 隱匿性:支原體污染初期很難被察覺,它們?cè)谄胀ü鈱W(xué)顯微鏡下幾乎不可見,因此細(xì)胞被支原體污染后,前期很難被發(fā)現(xiàn)。
4. 傳播途徑多樣:支原體可以通過細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞懸液、細(xì)胞培養(yǎng)用具等途徑迅速傳播。
5. 污染源 :支原體污染源包括細(xì)胞間的交叉污染、操作人員的口腔、皮膚,以及細(xì)胞培養(yǎng)用的組分如血清、培養(yǎng)液等。
6. 環(huán)境因素:實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、試驗(yàn)臺(tái)、超凈臺(tái)、培養(yǎng)箱等可能被支原體污染,引起細(xì)胞的污染。
7. 抗*素耐藥性:支原體可能對(duì)某些抗*素產(chǎn)生耐藥性,使得治*效果變差。
8. 檢測(cè)和清理方法的局限性:一些傳統(tǒng)的支原體檢測(cè)和清理方法可能不夠靈敏或有效,導(dǎo)致難以徹底清理支原體
支原體檢測(cè)的樣本用什么合適?

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支原體去除的原理通常涉及以下幾個(gè)方面:
1. 抗*素作用:使用特定的抗*素制劑來抑制支原體的生長(zhǎng)和繁殖。例如,含有喹諾酮類、四環(huán)素衍生物類和大環(huán)內(nèi)酯類抗*素的混合制劑,這些抗*素能夠抑制支原體的DNA和蛋白合成。
2. 破壞細(xì)胞膜:支原體去除劑中的抑菌肽(AMPs)成分通過破壞支原體細(xì)胞膜的完整性,導(dǎo)致支原體細(xì)胞死亡。
3. 抑制DNA復(fù)制:支原體去除劑通過抑制支原體DNA回旋酶活性,有效抑制支原體DNA的復(fù)制,從遺傳物質(zhì)著手徹底殺滅支原體。
4. 協(xié)同作用:某些支原體去除劑利用抑菌肽(AMPs)和穿膜肽(CPPs)的協(xié)同作用來除去支原體,穿膜肽能夠幫助抑菌肽更有效地穿透細(xì)胞膜,增強(qiáng)其殺滅支原體的能力。

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支原體去除試劑使用后,對(duì)支原體的檢測(cè)可能會(huì)有影響。一些支原體去除試劑通過特異性地與支原體膜結(jié)合、改變支原體膜的通透性來殺死支原體,而對(duì)真核細(xì)胞幾乎沒有影響。然而,某些情況下,去除試劑可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的活力和形態(tài)產(chǎn)生一定的影響,尤其是在去除劑作用期間。此外,如果去除劑的效果不徹底,可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞再次被支原體污染。

需要注意的是,某些支原體去除試劑可能會(huì)在去除支原體的過程中導(dǎo)致支原體膜溶解,從而釋放出支原體的DNA,這可能會(huì)在隨后的支原體核酸檢測(cè)中引起假陽性結(jié)果。因此,在去除支原體后,建議在繼續(xù)正常傳代培養(yǎng)幾代細(xì)胞后再進(jìn)行支原體檢測(cè),以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
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標(biāo)簽: 支原體 免疫沉淀