“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的結(jié)合蛋白,進(jìn)行小規(guī)模的蛋白質(zhì)親和純化的實(shí)驗(yàn)。更確切地說,IP是采用固定在微珠支持物(一般是瓊脂糖樹脂)上的特定抗體,從復(fù)雜的混合物中,純化單一抗原的實(shí)驗(yàn)。固定化蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝既可以分步進(jìn)行,也可以一步完成。
常見的加樣順序:抗體和樣本(如細(xì)胞裂解物)一起孵育,然后加入親和微珠,用于捕獲抗體-抗原復(fù)合物。也可以將抗體和微珠(通過抗體結(jié)合蛋白,如蛋白A、G或A/G等,直接或間接結(jié)合抗體)先進(jìn)行孵育,然后再加入含有抗原的樣本。當(dāng)抗原、抗體和固相支持物產(chǎn)生結(jié)合以后,充分洗滌微珠,再采用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液從支持物上洗脫抗原。
免疫沉淀技術(shù)IP實(shí)驗(yàn)步驟。北京Protein AG免疫沉淀外包公司
Co-IP(Co-Immunoprecipitation,共免疫沉淀)的實(shí)驗(yàn)方法通常包括以下步驟:
1. 細(xì)胞培養(yǎng)與裂解:細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下生長到適當(dāng)?shù)拿芏取?/span>
蛋白質(zhì)分離:裂解后的細(xì)胞混合物通過離心去除未破碎的細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞。收集上清液
2. 抗體的添加:將特異性抗體(針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體)加入到裂解物中。
3. 免疫復(fù)合物的形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后,形成免疫復(fù)合物。
4. 親和介質(zhì)的使用:向混合物中添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子(如瓊脂糖或磁性珠子)。
5. 免疫復(fù)合物的捕獲:將混合物與珠子孵育一段時(shí)間后,使用磁鐵或離心的方法將珠子收集起來,同時(shí)捕獲了與之結(jié)合的免疫復(fù)合物。
6. 洗滌:洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他分子。
7. 洗脫:使用適當(dāng)?shù)木彌_液將免疫復(fù)合物從珠子上洗脫下來,常用的緩沖液包括SDS樣品緩沖液,用于后續(xù)的電泳分析。
8. 蛋白質(zhì)分析:洗脫的蛋白質(zhì)可以通過SDS-PAGE凝膠電泳、Western blot、質(zhì)譜分析等方法進(jìn)行進(jìn)一步分析。
9. 實(shí)驗(yàn)對(duì)照:實(shí)驗(yàn)中應(yīng)包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
10. 數(shù)據(jù)分析:對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,確認(rèn)目標(biāo)蛋白是否成功沉淀,并鑒定任何可能的相互作用蛋白。
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免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用和純化特定蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法。
優(yōu)點(diǎn):
1. 特異性強(qiáng):利用特異性抗體捕獲目標(biāo)蛋白,可以有效地從復(fù)雜的生物樣本中分離出感興趣的蛋白質(zhì)。
2. 靈敏度高:可以檢測(cè)到低豐度的蛋白質(zhì),包括瞬態(tài)或弱相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
3. 應(yīng)用范圍廣:適用于多種生物樣本,如細(xì)胞裂解物、組織提取物和生物流體。
4. 生物學(xué)洞察深入:能夠揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò),有助于理解細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞和調(diào)控機(jī)制。
5. 可與其他技術(shù)聯(lián)用:如與質(zhì)譜(IP-MS)聯(lián)用,可以準(zhǔn)確鑒定蛋白質(zhì)及其相互作用伙伴。
缺點(diǎn):
1. 對(duì)抗體依賴性高:需要高親和力和高特異性的抗體,抗體的質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2. 可能存在非特異性結(jié)合:樣本中的其他蛋白質(zhì)可能與抗體或固相支持物發(fā)生非特異性結(jié)合,導(dǎo)致背景噪音。
3. 可能影響蛋白質(zhì)的天然狀態(tài):裂解和沉淀過程可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能。
4. 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性:需要多次實(shí)驗(yàn)來確保結(jié)果的可重復(fù)性和可靠性。
5. 樣品處理:需要避免樣品降解和非特異性結(jié)合,這可能需要使用蛋白酶抑制劑和適當(dāng)?shù)木彌_液條件。
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟:
1. 目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇:
2. 抗體的選擇:選擇特異性強(qiáng)、親和力高的抗體來捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì)
3. 樣本的準(zhǔn)備:收集和準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。
4. 蛋白質(zhì)的裂解和釋放:選擇合適的裂解條件,如pH值、離子強(qiáng)度、去污劑等。
5. 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定:確定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度,以便于后續(xù)步驟的標(biāo)準(zhǔn)化。
6. 免疫沉淀的操作:將特異性抗體與裂解液混合,并在適宜的條件下孵育,以形成抗體-抗原復(fù)合物。
7. 非特異性結(jié)合的減少:通過預(yù)純化步驟去除可能的非特異性結(jié)合蛋白。
8. 洗滌:多次洗滌以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。
9. 目標(biāo)蛋白質(zhì)的洗脫:使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫抗體-抗原復(fù)合物。
10. 后續(xù)分析:對(duì)洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析,如Western Blot.
11. 對(duì)照實(shí)驗(yàn):設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)恼龑?duì)照和負(fù)對(duì)照,以評(píng)估實(shí)驗(yàn)的特異性和敏感性。
免疫沉淀技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法。
免疫沉淀(immunoprecipitation)是指利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性,將抗原(常為靶蛋白)從混合體系沉淀下來,初步分離靶蛋白的一種方法。免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是一種在體外探測(cè)兩個(gè)蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理非常簡(jiǎn)單,如果兩個(gè)蛋白在體外體系能夠發(fā)生特異性相互作用的話,那么當(dāng)用一種蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí),另一個(gè)蛋白也會(huì)被同時(shí)沉淀下來。與酵母雙雜交技術(shù)不同,免疫共沉淀技術(shù)所利用的是抗原和抗體間的免疫反應(yīng),是一種基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的方法。
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免疫沉淀技術(shù)是什么?北京Protein AG免疫沉淀外包公司
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)復(fù)合物組成以及特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
基本原理
免疫沉淀技術(shù)基于抗體與特定蛋白質(zhì)(抗原)之間的特異性相互作用。通過使用針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體,可以從含有多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜樣本中捕獲并富集目標(biāo)蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)有多種類型,包括:
1. 個(gè)別免疫沉淀法(Individual IP)
2. 免疫共沉淀法(Co-IP)
3. 染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)
4. RNA免疫沉淀法(RIP)
近年來,免疫沉淀技術(shù)在固相支持物的選擇上有了很大進(jìn)步。磁性微珠因其操作簡(jiǎn)便、快速和自動(dòng)化程度高而逐漸取代了傳統(tǒng)的瓊脂糖樹脂。
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