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相對定量實(shí)驗(yàn)方法包括兩種重要方法：ΔΔCT Method：使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因。內(nèi)參基因與目的基因可以同時反應(yīng)，也可以單獨(dú)反應(yīng)；雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法：對每個樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做定量，求出每個樣品中內(nèi)參基因和目的基因的數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達(dá)。定量需要由標(biāo)準(zhǔn)曲線建立Ct值跟拷貝數(shù)之間的關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線由標(biāo)準(zhǔn)品生成，標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知濃度的RNA、質(zhì)粒或合成的寡核苷酸鏈生成，定量未知模板時標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品必須同時反應(yīng)。實(shí)時熒光定量PCR指在PCR反應(yīng)體系加入熒光基團(tuán)，熒光信號實(shí)時監(jiān)測PCR,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析.珠?？焖賟PCR...

染料法是指在qPCR反應(yīng)體系中加入一種與雙鏈DNA分子結(jié)合的熒光染料，包括SYBR?Green I、BEBO和LC Green TMI等染料，它們可以與雙鏈DNA（double strands DNA，dsDNA）的小溝非特異性結(jié)合，激發(fā)較強(qiáng)的熒光產(chǎn)生。經(jīng)熒光定量PCR儀器檢測后，對核酸進(jìn)行定性和定量分析。qPCR 染料法原理:這種方法的優(yōu)點(diǎn)是，需要一對特異性引物，操作簡單、檢測成本低。缺點(diǎn)是由于熒光染料非特異結(jié)合dsDNA產(chǎn)物，無法正確區(qū)分目的產(chǎn)物，尤其是染料結(jié)合引物二聚體易產(chǎn)生錯誤的擴(kuò)增曲線，易形成誤判。雖然在PCR擴(kuò)增程序后添加熔解曲線分析，可以方便判斷生成的熒光擴(kuò)增曲線是否屬于目的產(chǎn)物...

而在指數(shù)增長期，由于底物充足，聚合酶活性高，反應(yīng)產(chǎn)物以指數(shù)形式積累，且與初始模板量存在定量關(guān)系，因此，在該時期對模板起始量進(jìn)行定量分析準(zhǔn)確且重復(fù)性比較好。Ct值，是在指數(shù)增長期內(nèi)，熒光信號到達(dá)熒光檢測閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，其中C循環(huán)(Cycle)，t閾值（threshold)。每條擴(kuò)增曲線的Ct值都與初始模板量的對數(shù)存在線性關(guān)系，初始模板的拷貝數(shù)濃度越高，對應(yīng)的Ct值越小;反之則越大。因此，先根據(jù)已知拷貝數(shù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再將樣本擴(kuò)增曲線的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，便可計算未知樣本初始模板的拷貝數(shù)濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。q225pcr無需參比染料、無需定期校準(zhǔn)，更加簡化...

qpcr的檢測原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實(shí)時積累的熒光信號監(jiān)測整個擴(kuò)增過程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來對未知模板進(jìn)行定量分析。qPCR 主要是依賴于標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。隨著PCR的循環(huán)進(jìn)行，染料熒光強(qiáng)度增加，從而檢測到定量反應(yīng)的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時檢測。珠海高效qPCR儀儀器RealTimePCR是通過檢測反...

SYBR Green I染料試劑：SYBR Green I染料法采用了Applied Biosystems SYBR Green I染料，一種可以在PCR循環(huán)過程中隨著PCR產(chǎn)物的累計而對其進(jìn)行檢測的高度特異性雙鏈DNA結(jié)合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法為重要的區(qū)別在于SYBR Green I染料試劑可以檢測所有雙鏈DNA，包括非特異性的反應(yīng)產(chǎn)物。因此這樣經(jīng)過特別優(yōu)化的反應(yīng)體系，對于獲取準(zhǔn)確的結(jié)果而言是非常必要的。使用SYBR Green I染料法的檢測類型SYBR Green I染料法可用于以下檢測類型：用于RNA定量的一步法RT-PCR；用于RNA定量的兩步法RT-PC...

所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法?！eal-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。qPCR在原有PCR基礎(chǔ)上與熒光檢測方...

傳統(tǒng)定量PCR方法簡介：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根...

免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物使用抗體捕獲蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素?？贵w免疫沉淀并從細(xì)胞核組分中分離蛋白質(zhì)，去除不相關(guān)的細(xì)胞物質(zhì)。使用抗體結(jié)合磁珠完成所得抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的純化。經(jīng)過孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，純化并洗脫蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化:現(xiàn)在含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時可以停止ChIP。經(jīng)過解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)主要特...

qpcr的檢測原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實(shí)時積累的熒光信號監(jiān)測整個擴(kuò)增過程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來對未知模板進(jìn)行定量分析。qPCR 主要是依賴于標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。隨著PCR的循環(huán)進(jìn)行，染料熒光強(qiáng)度增加，從而檢測到定量反應(yīng)的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。q225 加樣孔板側(cè)壁和金屬熱塊能夠嚴(yán)密貼合，使液體樣品迅速達(dá)到設(shè)定溫度，從而減少實(shí)驗(yàn)時間。廣東Quantagene q225mxqPCR儀儀...

實(shí)時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通過在普通 PCR 反應(yīng)體系中加入了熒光標(biāo)記探針或熒光染料，利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物變化。通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。具有專一性更高、可實(shí)時監(jiān)控、可重復(fù)精確定量等優(yōu)勢。qPCR的種類根據(jù)qPCR的化學(xué)發(fā)光原理一般分為2大類：一類是探針法，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；一類是基于SYBR Green I 的染料法，通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。qPCR實(shí)現(xiàn)了通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量...

1983年，美國化學(xué)家Kary Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction， PCR)，這一技術(shù)將DNA聚合酶的特性結(jié)合核酸雙鏈的變性復(fù)性特性，采用適溫延伸、高溫變性以及低溫復(fù)性，讓目的核酸片段實(shí)現(xiàn)了特異性體外擴(kuò)增，可將極微量的目標(biāo)DNA特異地擴(kuò)增上百萬倍，從而提高對DNA分子的分析和檢測靈敏度。尤其是耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)，更是極大地促進(jìn)了PCR技術(shù)在分子生物學(xué)科研，及臨床分子診斷領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。常用的 PCR 技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）和實(shí)時熒光定量PCR（Real-time Quan...

qpcr的檢測原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實(shí)時積累的熒光信號監(jiān)測整個擴(kuò)增過程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來對未知模板進(jìn)行定量分析。qPCR 主要是依賴于標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。隨著PCR的循環(huán)進(jìn)行，染料熒光強(qiáng)度增加，從而檢測到定量反應(yīng)的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。dPCR可用于常規(guī)qPCR所需的標(biāo)準(zhǔn)品定量，具有計量學(xué)意義 。珠三角靈敏度qPCR儀報價而在指數(shù)增長期，由于底物充足，聚合酶活性高，反應(yīng)產(chǎn)物以...

SYBR Green I染料試劑：SYBR Green I染料法采用了Applied Biosystems SYBR Green I染料，一種可以在PCR循環(huán)過程中隨著PCR產(chǎn)物的累計而對其進(jìn)行檢測的高度特異性雙鏈DNA結(jié)合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法為重要的區(qū)別在于SYBR Green I染料試劑可以檢測所有雙鏈DNA，包括非特異性的反應(yīng)產(chǎn)物。因此這樣經(jīng)過特別優(yōu)化的反應(yīng)體系，對于獲取準(zhǔn)確的結(jié)果而言是非常必要的。使用SYBR Green I染料法的檢測類型SYBR Green I染料法可用于以下檢測類型：用于RNA定量的一步法RT-PCR；用于RNA定量的兩步法RT-PC...

TaqMan 方法的優(yōu)點(diǎn)：需要在探針和目標(biāo)分子（靶點(diǎn)）之間發(fā)生特異性的水解（雜交），方可生成熒光信號。可使用明顯不同的報告基因染料標(biāo)記探針，在一個反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測兩個不同的序列。無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。TaqMan方法的缺點(diǎn)：TaqMan方法的主要缺點(diǎn)在于需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針。SYBR Green I染料試劑。一般將可與雙鏈DNA發(fā)生結(jié)合的小分子分為以下兩類：嵌入劑、小溝結(jié)合物。無論哪種結(jié)合方法，用于PCR實(shí)時檢測的DNA結(jié)合染料都需要滿足以下兩個條件：結(jié)合至雙鏈DNA時，會有增強(qiáng)的熒光對 PCR 不會產(chǎn)生抑制我們開發(fā)更加優(yōu)化的條件，使得SYBR Gre...

qpcr的檢測原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實(shí)時積累的熒光信號監(jiān)測整個擴(kuò)增過程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來對未知模板進(jìn)行定量分析。qPCR 主要是依賴于標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。隨著PCR的循環(huán)進(jìn)行，染料熒光強(qiáng)度增加，從而檢測到定量反應(yīng)的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。q225pcr無需參比染料、無需定期校準(zhǔn)，更加簡化的操作流程與減輕的維護(hù)負(fù)擔(dān)只為更好地專注于實(shí)驗(yàn)。佛山Quantagene q225qPCR儀...

所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法?！eal-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。Quantagene q225 系列熒...

qPCR的實(shí)質(zhì)就是PCR反應(yīng)，只是在擴(kuò)增產(chǎn)物上增加了熒光標(biāo)記，通過儀器對熒光信號進(jìn)行采集。熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsDNA的濃度成正比，因此非理想條件下的PCR熒光強(qiáng)度Rn=R0+YnRs＝RB+Y0(1+Ex)^nRs （Rn：第n次循環(huán)時熒光信號強(qiáng)度，R0：背景信號強(qiáng)度，Rs：每個分子的熒光強(qiáng)度），通過對采集熒光信號就能進(jìn)行初始模板定量、基因表達(dá)量的研究。通過對PCR過程中熒光信號的實(shí)時監(jiān)測，熒光強(qiáng)度的變化趨勢，呈現(xiàn)出一條S型曲線即“擴(kuò)增曲線（Amplication plot）”，分為四個時期：基線期、指數(shù)擴(kuò)增期、線性增長期、平臺期。實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。湛...

利用SYBR Green I可以檢測PCR反應(yīng)中獲得的全部雙鏈DNA,但是不能區(qū)分不同的雙鏈DNA。為了進(jìn)一步確保熒光檢測的就是靶DNA序列，人們又設(shè)計了能與目的DNA序列特異結(jié)合的熒光探針，如TaqMan探針。TaqMan探針是一小段被設(shè)計成可以與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA（一般為50-150 bp）,并且該單鏈DNA的5'和3'端帶有短波長和長波長兩個不同熒光基團(tuán)。這兩個熒光基團(tuán)由于距離過近，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作用下發(fā)生熒光淬滅，因而檢測不到熒光。PCR反應(yīng)開始后，隨著雙鏈DNA變性產(chǎn)生單鏈DNA，TaqMan探針結(jié)合到與之配對的靶DNA序列上，并被具有外切酶活性的T...

而在指數(shù)增長期，由于底物充足，聚合酶活性高，反應(yīng)產(chǎn)物以指數(shù)形式積累，且與初始模板量存在定量關(guān)系，因此，在該時期對模板起始量進(jìn)行定量分析準(zhǔn)確且重復(fù)性比較好。Ct值，是在指數(shù)增長期內(nèi)，熒光信號到達(dá)熒光檢測閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，其中C循環(huán)(Cycle)，t閾值（threshold)。每條擴(kuò)增曲線的Ct值都與初始模板量的對數(shù)存在線性關(guān)系，初始模板的拷貝數(shù)濃度越高，對應(yīng)的Ct值越小;反之則越大。因此，先根據(jù)已知拷貝數(shù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再將樣本擴(kuò)增曲線的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，便可計算未知樣本初始模板的拷貝數(shù)濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。q225 加樣孔板側(cè)壁和金屬熱塊能夠嚴(yán)密貼合，使液...

qPCR技術(shù)的本質(zhì)是PCR技術(shù)，在擴(kuò)增的每個循環(huán)中模板DNA通過變性、復(fù)性、延伸三個階段形成更多數(shù)量的子代DNA，為下一個循環(huán)提供模板DNA。在每個循環(huán)結(jié)束后，儀器會激發(fā)熒光物質(zhì)并檢測一次熒光信號，那么每一個循環(huán)都會對應(yīng)一個熒光信號值，將所有熒光信號值用光滑的曲線進(jìn)行連接起來，便是 qPCR擴(kuò)增曲線。如圖所示，根據(jù)qPCR擴(kuò)增曲線整體趨勢，整個擴(kuò)增過程主要分為四個時期，分別是基線期、指數(shù)增長期、線性增長期和平臺期。在基線期和平臺期，熒光信號均維持水平狀態(tài)，均不適用于對初始模板進(jìn)行定量分析。在線性增長期，雖然擴(kuò)增反應(yīng)仍在進(jìn)行，但隨著反應(yīng)產(chǎn)物的積累，PCR反應(yīng)受到明顯抑制導(dǎo)致擴(kuò)增效率不斷降低，此時...

而在指數(shù)增長期，由于底物充足，聚合酶活性高，反應(yīng)產(chǎn)物以指數(shù)形式積累，且與初始模板量存在定量關(guān)系，因此，在該時期對模板起始量進(jìn)行定量分析準(zhǔn)確且重復(fù)性比較好。Ct值，是在指數(shù)增長期內(nèi)，熒光信號到達(dá)熒光檢測閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，其中C循環(huán)(Cycle)，t閾值（threshold)。每條擴(kuò)增曲線的Ct值都與初始模板量的對數(shù)存在線性關(guān)系，初始模板的拷貝數(shù)濃度越高，對應(yīng)的Ct值越小;反之則越大。因此，先根據(jù)已知拷貝數(shù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再將樣本擴(kuò)增曲線的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，便可計算未知樣本初始模板的拷貝數(shù)濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。qPCR熒光標(biāo)記法分為SYBR Green I染料...

Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)：快速 分秒必爭，43 分鐘完成40 循環(huán)qPCR 實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確 精細(xì)定量，數(shù)據(jù)可靠更勝一籌。節(jié)省 5-10 ul反應(yīng)體積，更少的試劑與樣品需求。小巧 輕巧身材，節(jié)約空間，更能輕松攜帶。的設(shè)計，出色的性能，為您的實(shí)驗(yàn)及研究提供超乎想象的便捷與準(zhǔn)確經(jīng)過嚴(yán)密設(shè)計的熱循環(huán)及光學(xué)系統(tǒng)在極大縮短運(yùn)行時間的同時，依舊能夠確保數(shù)據(jù)的精細(xì)。特制的小型96 孔板節(jié)約試劑和寶貴的樣品，并且保持較高的通量。 簡潔清晰的PC 端操作軟件，不同階段的 qPCR 儀使用者都可以迅速掌握，實(shí)驗(yàn)過程更加輕松快捷。無需參比染料、無需定期校準(zhǔn)，更加簡化的操作流程與減輕的維護(hù)負(fù)...

Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)主要特點(diǎn)：精確定量 以可靠的數(shù)據(jù)助力您的研究。采用擬合算法計算 Ct 值，定量誤差不超過±10%。液體冷卻循環(huán)系統(tǒng)確?？组g溫度高度一致，溫差不超過 ±0.15°C。光學(xué)系統(tǒng)無運(yùn)動部件，穩(wěn)定性增加，長期使用無需校準(zhǔn)與維護(hù)。的儀器間重復(fù)性，不同位置、不同反應(yīng)體積均不影響定量結(jié)果。快速高效 用更短的時間獲得更多數(shù)據(jù)。40 個循環(huán)的常規(guī) qPCR 只需43 分鐘，較常見qPCR 儀多縮短60% 的時間。在提高速度的同時保持了96 孔的高通量，滿足絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)需求。小巧輕便 節(jié)省空間及您的寶貴樣品小體積為移動實(shí)驗(yàn)和大量部署提供可能。5-10 μl ...

qPCR的熒光標(biāo)記方法分為以SYBR Green I染料法為主的熒光染料嵌合法，以Taqman探針法為主的熒光探針法（Cycling Probe，Molecular Bracon等），淬滅染料引物法。SYBR Green I 是高靈敏度的非特異性雙鏈DNA熒光染料，具有綠色激發(fā)波長。它以非特異性方式結(jié)合在dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域。游離的SYBR Green I 只發(fā)出極弱的熒光信號，PCR過程中，當(dāng)擴(kuò)增生成dsDNA時，SYBR Green I 逐漸與dsDNA結(jié)合，熒光信號被千倍放大，熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsDNA的濃度成正比。熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴(kuò)增曲線”，通過熒光信號的強(qiáng)...

實(shí)時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通過在普通 PCR 反應(yīng)體系中加入了熒光標(biāo)記探針或熒光染料，利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物變化。通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。具有專一性更高、可實(shí)時監(jiān)控、可重復(fù)精確定量等優(yōu)勢。qPCR的種類根據(jù)qPCR的化學(xué)發(fā)光原理一般分為2大類：一類是探針法，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；一類是基于SYBR Green I 的染料法，通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。SYBR Green I 是一種結(jié)合于所有雙鏈DNA（ds...

原理：在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，通過熒光化學(xué)物質(zhì)測定每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量。目的：實(shí)現(xiàn)定量而不止是定性分析。通過與內(nèi)參基因進(jìn)行對比，對樣品中的特定基因進(jìn)行相對表達(dá)量的計算，以實(shí)現(xiàn)定量分析。qPCR的檢測方法有兩種，SYBRGreenl法和TaqMan探針法，下面介紹常用的SYBRGreenl法。原理：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，使其特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。試劑及儀器：Hieff?QpcrSYBR?GreenMasterMix試劑(翌圣)和ABI7500Real-T...

在實(shí)驗(yàn)室和診所中越來越多地使用 dPCR 研究實(shí)驗(yàn)室和診所都受益于 dPCR 靈敏度的提高。“隨著細(xì)胞和基因研究和開發(fā)的不斷發(fā)展，開發(fā)人員越來越多地轉(zhuǎn)向 dPCR 來精確測量不同的目標(biāo)，包括工程病毒載體、基因編輯事件、質(zhì)粒和完整衣殼，”Hung說。學(xué)和移植等臨床領(lǐng)域也受益于 dPCR 檢測稀有 DNA 的能力，以及量化稀有 DNA 中微小但有的倍數(shù)變化。例如，dPCR 用于檢測患者的循環(huán) DNA，并評估細(xì)胞和基因的正確劑量?！半S著精細(xì)醫(yī)學(xué)變得越來越主流，我們預(yù)計 ddPCR 將在臨床中變得更加普遍，因?yàn)?ddPCR 可以檢測負(fù)荷響應(yīng)的微小變化，”Alsarraj 說。“例如，使用 ddPCR ...

定量方法包括相對定量和定量，兩者的重要差異在于相對定量的結(jié)果是差異性的結(jié)果，涉及比較；而定量的結(jié)果是一個具體數(shù)值，對于基因表達(dá)量而言是基因的拷貝數(shù)，不涉及任何比較。相對定量首先需要確定一個內(nèi)參基因，內(nèi)參基因作用有檢測樣本材料中RNA是否降解、糾正樣本加樣的差異、校正cDNA合成速率差異及校正PCR抑制劑的影響，其本質(zhì)作用是利用內(nèi)參基因的Ct值對目的基因的Ct值進(jìn)行均一化處理，常用的內(nèi)參基因包括DH、β-actin、18S rRNA，使用的時候需要注意其序列必須是物種本身的特異序列，雖然其比較保守，但不同物種也會存在堿基差別。另外，相對定量需要確定參照物，因?yàn)樯婕氨容^，參照物選擇不同，所得的定量...