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PD-1免疫組化

來源: 發(fā)布時間:2023-11-27

細胞免疫熒光實驗注意事項:非特異性染色:是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶;孵育過程中干片;抗原熱修復過度。染色過深:一抗?jié)舛冗^高;染色試濃度過高或孵育時間過長;染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細胞再進行通透,但若檢測抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號;建議設(shè)陰性對照組,消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色;選擇醛類固定液時,保持其新鮮度,較好現(xiàn)配現(xiàn)用,使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。PD-1免疫組化

PD-1免疫組化,免疫

基于熒光成像的技術(shù)對于查詢細胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用。當與免疫化學結(jié)合時,熒光成像技術(shù)的分析能力增加,增強了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實用性,使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過使活細胞成像能夠可視化整個細胞器,徹底改變了細胞生物學領(lǐng)域。免疫組織化學和免疫細胞化學是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進行細胞分析的常用熒光成像技術(shù)。免疫熒光(IF)是一種強大的免疫染色技術(shù),利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標分子結(jié)合的熒光素標記抗體。免疫熒光用于鑒定細胞中的細胞和組織特異性抗原;可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細胞定位和活化狀態(tài);并分析免疫反應(yīng)。PD-1免疫組化熒光抗體技術(shù)可以用于檢測和定位細胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。

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免疫熒光固定(防止離體組織自溶抗原擴散),固定液包括:有機溶劑(甲醇、乙醇等);交聯(lián)劑(4%PFA、10%中性福爾馬林),固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性,不過,目前甲醛用的還是較多的,但針對磷酸化的抗體,不適合用甲醛,會導致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇,同時應(yīng)注意甲醛會揮發(fā),在4-8°C不宜儲存太久。固定時間:取決于組合塊的大小和類型,對于大多數(shù)組織,18-24h較為理想,細胞固定時間較短,一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細胞樣品為例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。

熒光的產(chǎn)生:一此化學物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學能等)而進入激發(fā)態(tài),當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時,過剩的能量可以電磁輻射的形式放射(即發(fā)光)。熒光發(fā)射的特點是:可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光;而一旦停止供能,發(fā)光(熒光)現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失??梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多,由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學應(yīng)所引起的稱為化學熒光,由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標記。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,用于定位組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。

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免疫熒光間接法測抗體實驗步驟:滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原標本片,10min后棄去,使標本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本,覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗1-2次,然后按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不時振蕩。取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。重復操作3。取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結(jié)果判定同直接法。免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答。TLR4免疫

免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用。PD-1免疫組化

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢:定量熒光信號的能力(與使用基于酶的方法進行的定性測定相反);復用能力(可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì));熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標本,熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見熒光所在的組織細胞,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測定含量。PD-1免疫組化