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P62免疫熒光檢查

來源: 發(fā)布時間:2023-11-26

細胞免疫熒光:細胞種板與細胞爬片制備:1) 細胞密度在90%-95%左右,用預熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中,充分吹打,使之成單細胞懸液,計數(shù)。2)取細胞培養(yǎng)12孔板,在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,先在每個孔里準備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,然后將爬片置于液滴上,壓緊,使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,防止加細胞懸液時爬片漂起,造成雙層細胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi)。3)24h或者48h后,根據(jù)細胞生長速度快慢,觀察判斷細胞密度,約90%時進行細胞免疫熒光。免疫熒光技術可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。P62免疫熒光檢查

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免疫熒光固定(防止離體組織自溶抗原擴散),固定液包括:有機溶劑(甲醇、乙醇等);交聯(lián)劑(4%PFA、10%中性福爾馬林),固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性,不過,目前甲醛用的還是較多的,但針對磷酸化的抗體,不適合用甲醛,會導致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,故應選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇,同時應注意甲醛會揮發(fā),在4-8°C不宜儲存太久。固定時間:取決于組合塊的大小和類型,對于大多數(shù)組織,18-24h較為理想,細胞固定時間較短,一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細胞樣品為例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。IL-6免疫熒光IF免疫熒光技術可以用于研究病毒傳播和免疫應答。

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細胞的固定及免疫熒光:注意事項:(1)取細胞爬片時,動作應輕柔,防止將細胞爬片夾碎,影響實驗進程。(2)種細胞過程中,要注意將細胞輕柔混勻,“八”字或者“十”字形搖晃,防止細胞局部生長過密。(3)稀釋、加二抗(熒光抗體)及此后的洗滌過程中注意避光。(4)細胞爬片進行免疫熒光之后,需要盡快拍照,防止免疫熒光淬滅?;蛘叻庞诎岛袃?nèi),暫時保存于4度冰箱,盡快拍照。(5)在進行熒光顯微鏡拍照時,要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色,只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。

熒光色素:四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長為550nm,較大發(fā)射光波長為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。免疫熒光技術又稱熒光抗體技術,是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。

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細胞的固定及免疫熒光:吸去一抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,37℃,室溫避光孵育1小時。注意二抗帶有熒光素標記,因此操作過程盡量在暗處進行。吸去二抗,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,或者Hoechst復染細胞核,一般為藍色熒光;避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細胞3 次,每次 5 min,洗去多余的DAPI。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,張力較大,可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,注意選擇抗體對應的激發(fā)光源。免疫熒光技術是一種利用熒光物質(zhì)標記抗體來定位抗原的技術。P-AKT免疫檢測

免疫熒光技術可以用于研究細胞分裂和細胞周期。P62免疫熒光檢查

zo-1的免疫熒光,步驟如下:1.細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時,從孵箱中取出。2.用預溫的1×PBS洗3次,每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次,每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次,每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗(用1%BSA稀釋)放在濕盒里,4度過夜。9.1×PBS洗3次,每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,閉光。11.1×PBS洗3次,每次10分鐘。12.95%甘油封片。注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀釋。P62免疫熒光檢查