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陜西anti-Flag COIP免疫磁珠性能

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2022-02-15
COIP 磁珠緩沖液匯總

細(xì)胞裂解液
正常RIPA 細(xì)胞裂解緩沖液(一般是公司購(gòu)買)
結(jié)合緩沖液binding buffer
用RIPA 細(xì)胞裂解緩沖液代替
洗滌緩沖液Washing buffer
PBST(1*PBS + 1% Triton X-100)
洗脫緩沖液Elution buffer
直接加入1*蛋白loading buffer, 98oC 5 min后棄去磁珠后,收集上清液檢測(cè)。

COIP 常見(jiàn)問(wèn)題及對(duì)策


用免疫磁珠法檢測(cè)抗白念珠*烯醇化酶抗體。陜西anti-Flag COIP免疫磁珠性能

常見(jiàn)問(wèn)題
原因
解決方法
高的背景條帶
蛋白非特異結(jié)合到抗體,磁珠或EP管上洗滌次數(shù)不夠
對(duì)裂解液進(jìn)行預(yù)處理去除非特異蛋白; 在***一次洗滌前, 轉(zhuǎn)移整個(gè)樣品到新的EP管中然后進(jìn)行離心。
洗滌次數(shù)不夠
增加洗滌的時(shí)間和次數(shù)。
無(wú)蛋白條帶
Myc 標(biāo)簽蛋白沒(méi)有表達(dá)
確保目的蛋白帶有Flag/HA/Myc 標(biāo)簽; 制備新鮮的裂解液; 使用恰當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿?/span>
孵育時(shí)間不足
增加孵育時(shí)間。
樣品中存在干擾物質(zhì)
裂解液中存在高濃度的DTT,2-mercaptoetMyc nol或者其他的還原劑;

免疫磁珠技術(shù)(immunomagneticbeads,IMB)是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的一種新的免疫學(xué)技術(shù).隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展,納米免疫磁珠具備了良好的磁感應(yīng)性,超順磁性,高特異性,高濃縮性,高分離率,且不影響細(xì)胞活性等優(yōu)點(diǎn),因此它能從大量外周血細(xì)胞中篩選出帶有特異性制備可高效,特異地分離單增李斯特菌的免疫磁珠.探討羧基修飾磁珠與多克隆抗體的不同偶聯(lián)條件和免疫磁珠捕獲單增李斯特菌的能力.方法:以單增李斯特菌作為抗原,免疫新西蘭兔,獲得兔源多克隆抗體,鑒定其與單增李斯特菌體的結(jié)合能力;選擇6種不同的偶聯(lián)緩沖溶液,設(shè)置了6個(gè)主要偶聯(lián)時(shí)間和6組偶聯(lián)溫度,通過(guò)比較磁珠與抗體偶聯(lián)后上清中剩余的抗體量來(lái)確定比較好偶聯(lián)條件.結(jié)果:制備的多克隆抗體效價(jià)為1.3×105,該抗體與單增李斯特菌體有較好的結(jié)合,抗體與1mg羧基修飾磁珠在pH6.0的0.01mol/L一水嗎啉乙磺酸緩沖溶液(MES)中,37℃偶聯(lián)2h,偶聯(lián)抗體的量為160μg;制得的免疫磁珠的捕獲率可達(dá)77.0%.結(jié)論:獲得羧基磁珠與抗體偶聯(lián)的比較好條件,該免疫磁珠用于食品中單增李斯特菌的檢測(cè),與常規(guī)的平皿增菌培養(yǎng)顯色法比較,檢測(cè)時(shí)間至少縮短20h.標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞遼寧anti-Flag 免疫共沉淀免疫磁珠代理價(jià)格4折起空腸彎曲菌免疫磁珠富集方法的建立。

COIP實(shí)驗(yàn)步驟
第三步:免疫共沉淀
根據(jù)不同的抗體結(jié)合方式,這里的免疫共沉淀步驟會(huì)稍有不同,但是本質(zhì)是一樣的,都是為了形成抗原-蛋白復(fù)合物。
如果直接使用 Protein A/G 結(jié)合的 beads,先進(jìn)行細(xì)胞裂解液/蛋白混合物與抗體的孵育,再加入 beads 將蛋白-抗體復(fù)合物拉下來(lái)。
如果使用了交聯(lián)劑將抗體與 Protein A/G 固定,或者直接將抗體固定在 beads,則將固定抗體的 beads 與細(xì)胞裂解液或則蛋白混合物一起孵育。
增加在洗脫之前的洗滌次數(shù)或在免疫共沉淀緩沖液中加入 Triton X-100 ,可以降低非特異性結(jié)合,以防止蛋白在陰性對(duì)照樹(shù)脂實(shí)驗(yàn)樣品中被檢測(cè)到。
第四步:洗脫與檢測(cè)
***一步則是使用洗脫緩沖液將互作蛋白復(fù)合物洗脫,并通過(guò) Western Blot 或者 Mass spectra 檢測(cè)鑒定蛋白。當(dāng)?shù)鞍谆蚩贵w對(duì)低 pH 的緩沖液敏感,可使用中性 pH 值的洗脫緩沖液。
注意事項(xiàng):
如后續(xù)需進(jìn)行酶活或功能性分析,則需使用兼容下游檢測(cè)的 Elution buffer 進(jìn)行洗脫。
對(duì)于交聯(lián)劑結(jié)合的 beads,為了保持抗體偶聯(lián)樹(shù)脂的活性,應(yīng)立即再生和存儲(chǔ)樹(shù)脂,保證抗體可以重復(fù)利用。

免疫磁珠細(xì)胞分選方法可以在幾分鐘內(nèi)從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中分離出很高純度的細(xì)胞。把細(xì)胞用超級(jí)順磁性的免疫磁珠特異性地標(biāo)記,磁性標(biāo)記完后,把這些細(xì)胞通過(guò)一個(gè)放在強(qiáng)而穩(wěn)定磁場(chǎng)中的分選柱。分選柱里的基質(zhì)造成一個(gè)高梯度磁場(chǎng)。被磁性標(biāo)記的細(xì)胞滯留在柱里而未被標(biāo)記的細(xì)胞則流出。當(dāng)分選柱移出磁場(chǎng)后,滯留柱內(nèi)的磁性標(biāo)記細(xì)胞就可以被洗脫出來(lái),這樣就完全可以獲得標(biāo)記和未標(biāo)記的兩個(gè)細(xì)胞組份。超順磁性的磁珠的體積很小,其直徑約為50nm,體積約小于真核細(xì)胞的一百萬(wàn)份之一,可與病毒的大小相比。標(biāo)記細(xì)胞上的微型磁珠即使在掃描電鏡照片上也幾乎看不到。磁性抗體和磁性標(biāo)記物間的反應(yīng)可在幾分鐘內(nèi)完成。由于微型磁珠的體積極小,所以不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性壓力,而且使孵育時(shí)間短,操作過(guò)程快。免疫磁珠形成一個(gè)穩(wěn)定的膠體液,它們?cè)诖艌?chǎng)中既不沉淀又不凝聚。微型磁珠的大小和它的組成成份(氧化鐵和多糖)使其可被生物降解,且不會(huì)***細(xì)胞或影響細(xì)胞的功能和活力,細(xì)胞的生理功能也不變。磁珠不需要去除,因此,陽(yáng)性分選出的細(xì)胞(即磁性標(biāo)記細(xì)胞)可立即用于分析和隨后的實(shí)驗(yàn)。H9亞型禽流感病毒免疫磁珠分離方法初步建立。

免疫共沉淀(COIP)實(shí)驗(yàn)過(guò)程
(1)轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細(xì)胞,加入適量細(xì)胞裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑),冰上裂解30min, 細(xì)胞裂解液于4°C, 最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清;
(2)取少量裂解液以備Western blot分析,剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液,4°C緩慢搖晃孵育過(guò)夜;
(3)取10μl protein A 瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3 次,每次3,000 rpm離心3 min;
(4)將預(yù)處理過(guò)的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h,使抗體與protein A瓊脂糖珠耦聯(lián);
(5)免疫沉淀反應(yīng)后,在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3-4次;***加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液,沸水煮5分鐘;
(6)SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析。
注意的問(wèn)題:
(1)細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的,通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的cocktailer。
(2)使用明確的抗體,可以將幾種抗體共同使用。
(3)使用對(duì)照抗體:

免疫磁珠法分離成人骨髓來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特征。陜西anti-Flag COIP免疫磁珠性能

基于免疫磁珠分散聚集狀態(tài)檢測(cè)病原體與Cancer癥標(biāo)志物。陜西anti-Flag COIP免疫磁珠性能

人腦**組織中分離,培養(yǎng),純化和鑒定腦**干細(xì)胞(BTSCs),探討CD133免疫磁珠分選方法獲取BTSCs的可行性及BTSCs的生物學(xué)特性.方法:留取人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤新鮮標(biāo)本,分離獲得腦腫瘤細(xì)胞.應(yīng)用CD133免疫磁珠分選方法純化BTSCs;流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選陽(yáng)性率;神經(jīng)球計(jì)數(shù)法分析CD133+/-亞群細(xì)胞神經(jīng)球形成情況;免疫熒光方法檢測(cè)CD133+/-亞群細(xì)胞表面神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)標(biāo)記物CD133,神經(jīng)巢蛋白(nestin)表達(dá)情況;檢測(cè)CD133+/-亞群細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后細(xì)胞表面分化標(biāo)記物β-TubulinⅢ,GFAP表達(dá)情況.結(jié)果:CD133+亞群細(xì)胞具有干細(xì)胞特性,可形成明顯的神經(jīng)球,具有自我更新和明顯的增殖能力,并且NSCs標(biāo)記物CD133,nestin表達(dá)陽(yáng)性,經(jīng)誘導(dǎo)分化后分化標(biāo)記物β-TubulinⅢ,GFAP表達(dá)陽(yáng)性;CD133-亞群細(xì)胞無(wú)上述特性.結(jié)論:CD133免疫磁珠分選方法獲得的CD133+亞群細(xì)胞即為BTSCs,該方法可以得到高純度的BTSCs,可以用于BTSCs的實(shí)驗(yàn)研究.陜西anti-Flag COIP免疫磁珠性能

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標(biāo)簽: 免疫磁珠