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北京anti-Flag 免疫共沉淀免疫磁珠生產廠家

來源： 發(fā)布時間：2022-01-29

免疫共沉淀檢測（CO-IP）

BEENbio提供免疫共沉淀（CO-IP）檢測服務。可對兩種已知蛋白是否存在相互作用進行驗證，也可以驗證在總蛋白中是否含有與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其實驗方法為將靶蛋白（X）與目的蛋白（Y）在同一細胞內孵育，形成“靶蛋白-目的蛋白”復合物。將靶蛋白的特異性抗體與復合物共孵育，形成“抗體-靶蛋白-目的蛋白”復合物，利用Proterin A/G純化。通過SDS-PAGE銀染，結合Western Blot及液相質譜等對兩種蛋白之間是否存在相互作用進行定性分析。

服務優(yōu)勢

?       使用銀染技術，靈敏度是考馬斯亮藍100倍，SDS-PAGE電泳結果更加清晰；

?       擁有液相質譜及Fortebio等完整配套檢測設備，可對檢測結果進一步分析；

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免疫共沉淀（COIP）實驗過程
（1）轉染后24-48 h 可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C， 最大轉速離心30 min后取上清；
（2）取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；
（3）取10μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離心3 min；
（4）將預處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠耦聯(lián)；
（5）免疫沉淀反應后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；***加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；
（6）SDS-PAGE, Western blotting或質譜儀分析。
注意的問題：
（1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質－蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2%SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。
（2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。
（3）使用對照抗體：

北京anti-Flag 免疫共沉淀免疫磁珠生產廠家抗熒光素單克隆抗體免疫磁珠的制備及初步應用。

用多聚抗原肽(multipleantigenpeptides,MAP)包被磁珠制備單表位抗體的方法.方法:通過Fmoc法固相化學合成UreB的8分支單表位MAP,將其作為免疫原免疫小鼠,獲得多克隆抗血清.將MAP以共價偶聯(lián)的方式包被磁珠制備免疫磁珠(immunomagneticbeads,IB),通過IB從多克隆抗血清中純化單表位抗體,熒光偏振(fluorescencepolarization,FP)法鑒定抗體的特異性,SDS-PAGE鑒定抗體純度,紫外分光光度法測定其回收率.結果:合成的MAP具有較強的免疫原性,免疫小鼠后得到的抗體滴度高達1∶12800.MAP制備免疫磁珠的比較好包被濃度為100mg/L,包被效率比較高可達79%.應用MAP免疫磁珠從抗血清中純化得到的單表位抗體,經鑒定與其他抗原表位無反應性,其純度為95%,抗體的回收率為5.8%.結論:MAP包被的磁珠可快速分離純化出針對某一抗原表位的特異性抗體,其性質類似單克隆抗體.這一方案在快速制備少量高特異性抗體中具有廣闊的應用前景.

精原干細胞(spermatogonialstemcells,SSCs)富集純化是利用SSCs進行基因修飾新方法等研究的前提基礎。采用免疫磁珠分選法,使用干細胞抗體CD90.2進行小鼠SSCs的純化富集,并采用流式細胞分析法和定量PCR驗證了磁珠分選效率。流式細胞分析結果:免疫磁珠分選后SSCs純度為50.11%。熒光定量PCR檢測結果:磁珠分選后支持細胞特異表達基因GATA4***下調(6倍)、SSCs表達基因GFRα-1上調(6.5倍)、生殖干細胞特異表達基因OCT4極***上調(5.9倍),3個基因相對表達量的變化說明,免疫磁珠分選效率為6倍。流式細胞分析法所產生的偏差可能是受到了未解離磁珠及SSCs本身轉基因熒光的影響。抗原肽免疫磁珠檢測BLV抗體的研究。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。當用預先固化在agarosebeads上的蛋白質A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內結合的蛋白質B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內與興趣蛋白天然結合的，符合體內實際情況，得到的結果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。免疫磁珠捕獲法分離抗酸桿菌的實驗研究。河南anti-Flag 免疫共沉淀免疫磁珠批量定制

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從白血病KG1a細胞中分選CD34+CD38-干細胞并研究其生物學特性.方法免疫磁珠法分選CD34+CD38-細胞,流式細胞術分析細胞表面膜抗原,細胞周期,甲基纖維素培養(yǎng)體系觀察其克隆性;以HL60,K562,CD34+CD38+細胞為對照,甲基偶氮唑藍法檢測柔紅霉素對CD34+CD38-細胞的抑制作用;BALB/c裸鼠皮下接種,觀察體內成瘤能力.結果分選的CD34+CD38-細胞純度達95%以上,(69.03±3.25)%處于G0期,克隆形成率為(38.64±2.68)%,明顯抵抗柔紅霉素;不同濃度柔紅霉素作用后,CD34+CD38-,CD34+CD38+,HL60,K562細胞的活性差異有統(tǒng)計學意義(F=961.136,P=0.000);CD34+CD38-在裸鼠皮下成瘤率***高于CD34+CD38+細胞(P〈0.05).結論免疫磁珠法分選白血病干細胞簡單易行,分選的細胞符合白血病干細胞生物學特性.北京anti-Flag 免疫共沉淀免疫磁珠生產廠家

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