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免疫組化的局限性,可能會(huì)有假陽(yáng)性。陽(yáng)性信號(hào)定位不正確即為假陽(yáng)性,包括著色不勻、背景著色、邊緣效應(yīng),另外組織的某些特定成分也能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。假陽(yáng)性可能的原因有:(1)一抗?jié)舛燃耙豢故欠袷В贵w有一個(gè)合適的濃度范圍且必須在有效期內(nèi)使用,過(guò)期的抗體或者不著色,或者背景著色,形成假陽(yáng)性;(2)試劑未充分覆蓋組織,組織邊緣的試劑易干濃度較組織中間高致深染;(3)抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),由于室溫的影響夏季孵育時(shí)間稍短,冬季孵育時(shí)間稍長(zhǎng);(4)操作過(guò)程中組織變干,造成組織邊緣收縮或損壞形成偽影,產(chǎn)生假陽(yáng)性;(5)3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色時(shí)間太長(zhǎng),DAB宜現(xiàn)配現(xiàn)用,配制時(shí)間比較好在30min以內(nèi);(6)由于胞漿里含有較多的蛋白質(zhì),因此間質(zhì)和胞漿中出現(xiàn)很多非特異性的染色,如內(nèi)源性酶血紅蛋白、肌紅蛋白等造成的著色,可以通過(guò)血清封閉解決;乳腺cancer組織中的脂肪細(xì)胞、淋巴細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生非特異性的染色;(7)非特異性抗體吸附常見(jiàn)于壞死組織中,使壞死組織呈較高的背景染色,在免疫組化中應(yīng)避免選擇壞死組織較多的蠟塊。英瀚斯實(shí)驗(yàn)外包,病理染色切片免疫組化,效率高!青海做得好的免疫組化推薦
實(shí)驗(yàn)失敗常見(jiàn)問(wèn)題分析有哪些:
為什么在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)所有的切片都成陰性?
答:這種現(xiàn)象主要是由操作不當(dāng)導(dǎo)致,可能的原因有:1.染色操作不當(dāng),致使染色失??;2.漏加一種抗體或者制備出的抗體沒(méi)有活性;3.緩沖液中有疊氮化鈉,抑制了酶的活性;4.復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)?shù)?。建議逐一排查,找到原因后重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)所有的切片都成陽(yáng)性,這是為什么?答:與上一個(gè)問(wèn)題類(lèi)似,出現(xiàn)的原因也是試驗(yàn)操作存在問(wèn)題,可能的原因有:1.切片在染色過(guò)程中抗體過(guò)濃,或者干片了;使用的呈色底物溶液已變色或呈色反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng);3.抗體溫育的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等。
在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)切片的背景很深,這是為什么?答:以下幾方面會(huì)導(dǎo)致切片的背景過(guò)深:1.蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血,造成抗體的非特異性反應(yīng);2.內(nèi)源性過(guò)氧化酶沒(méi)有完全阻斷,顯色過(guò)程中過(guò)氧化酶與酶底物反應(yīng),造成背景;3.底物呈色反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或呈色反應(yīng)后漂洗不徹底。 四川免疫組化怎么樣有沒(méi)有做免疫組化比較好的公司?
免疫組化實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)總結(jié):
?本實(shí)驗(yàn)室所用切片一般是石蠟切片。
?烘片:使蠟片水分蒸發(fā),石蠟軟化,組織切片牢固貼在玻片上;烘片至跟烘片前透明度有差異。
?抗原修復(fù)時(shí),使片子始終浸沒(méi)在修復(fù)液中,液體不能干。
?一抗孵育在37度培養(yǎng)箱,濕盒放置1h,省時(shí)間和結(jié)合效果好,不要超過(guò)1h,容易過(guò)染。
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?二抗使用:兩個(gè)二抗放大信號(hào)或一個(gè)二抗;若抗體信號(hào)強(qiáng),可不用放大信號(hào),盡量增大信噪比。
?10XDAB在常溫溶解,盡可能現(xiàn)用現(xiàn)配,放于4度儲(chǔ)存時(shí)間久了效果不佳。
?復(fù)水和脫水時(shí)所用的梯度酒精不可混用,要區(qū)分開(kāi)。
?加抗體和顯色液時(shí),都要將片子甩干,在半干半濕的狀態(tài)下再加,不然容易造成溶液的二次稀釋。
?整個(gè)操作過(guò)程中在顯色之前,一定不能干片。
免疫組化的結(jié)果分析:
免疫組化實(shí)驗(yàn)通常需要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(或替代對(duì)照)(陽(yáng)性對(duì)照是排除方法和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有無(wú)問(wèn)題;陰性對(duì)照與替代對(duì)照是排除有無(wú)非特異性染色)。一般情況下,陽(yáng)性對(duì)照顏色的特點(diǎn)為:Ag定位,包漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。且染色的強(qiáng)度不同(顏色深淺不一);陰性對(duì)照的特點(diǎn)為:染色細(xì)胞與組織無(wú)區(qū)別,顏色具有彌散性,分布均勻。
英瀚斯生物可承接各類(lèi)病理染色,包括免疫組化。
說(shuō)明:免疫組化實(shí)驗(yàn)可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析,但要實(shí)驗(yàn)得到的必須是高質(zhì)量的染色切片,要求背景染色淺且特異性染色較深,這樣分析的結(jié)果才會(huì)比較準(zhǔn)確。 免疫組化可以看什么?
免疫組化臨床應(yīng)用對(duì)“未分化”cancer的分類(lèi)。未分化cancer包括cancer或肉瘤,在HE切片上由于cancer的“未分化”而缺少cancer細(xì)胞的起源特征不能分類(lèi),初步區(qū)分組織學(xué)類(lèi)型用非特異性抗體,在其基礎(chǔ)上再選用特異性抗體做進(jìn)一步鑒定。如分化差的cancer可顯示Vimentin或S-100蛋白,有時(shí)淋巴瘤可以表達(dá)上皮膜抗原,一些黑色素瘤表現(xiàn)出角蛋白,這同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了在cancer診斷中應(yīng)使用一組抗體而不是單個(gè)抗體。如果您有實(shí)驗(yàn)外包的需求,可以與我們南京英瀚斯生物進(jìn)行聯(lián)系,我們也有做免疫組化的服務(wù)!免疫組化如何得到好的效果?青海做得好的免疫組化推薦
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免疫組化結(jié)果背景染色較深的原因有哪些?
(1)抗體濃度過(guò)高:一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是,每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試,使每一抗體個(gè)體化,找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度,既使是即用型的抗體也應(yīng)如此,不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。
(2)抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高:解決辦法是,嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程,比較好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘,及時(shí)提醒,避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)?,F(xiàn)在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí),而是30分鐘,因此,要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
(3)DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng):DAB比較好現(xiàn)用現(xiàn)配,如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng),因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下,過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力,未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色比較好在顯微鏡下監(jiān)控,達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。但是當(dāng)染**太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí),這樣做似乎不現(xiàn)實(shí),但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控,避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
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