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二代測(cè)序的建庫(kù)步驟①
一、樣本準(zhǔn)備
樣本采集:根據(jù)研究目的采**適的樣本,如血液、組織、細(xì)胞等。例如,在**研究中,可能會(huì)采集**組織和對(duì)應(yīng)的正常組織。對(duì)于血液樣本,一般采用靜脈穿刺采集外周血,收集在含有抗凝劑(如EDTA)的**管中,以防止血液凝固。組織樣本則需要在合適的條件下盡快處理,以保持核酸的完整性。如果是新鮮組織,可將其置于液氮中速凍,然后保存在-80℃冰箱中。
核酸提?。簭臉颖局刑崛「哔|(zhì)量的DNA或RNA。對(duì)于DNA提取,常用的方法有酚-氯仿抽提法和商業(yè)化的DNA提取試劑盒。酚-氯仿抽提法是利用酚和氯仿使蛋白質(zhì)變性,離心后使DNA處于水相,從而實(shí)現(xiàn)分離。試劑盒則是基于吸附柱的原理,DNA在特定的緩沖液條件下吸附在硅膠膜上,經(jīng)過(guò)洗滌和洗脫步驟得到純凈的DNA。RNA提取過(guò)程中,需要特別注意防止RNA酶的污染,因?yàn)镽NA酶***存在且很穩(wěn)定,容易降解RNA。一般會(huì)使用含有RNA酶抑制劑的試劑,如焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水來(lái)配制試劑,并且操作過(guò)程要在無(wú)RNA酶的環(huán)境中進(jìn)行,如使用無(wú)RNA酶的***頭和離心管。常用的RNA提取方法是Trizol法,Trizol試劑可以同時(shí)破碎細(xì)胞并使RNA與蛋白質(zhì)和DNA分離,然后通過(guò)氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟得到RNA。 denovo測(cè)序是二代測(cè)序嗎?河北嘉安健達(dá)二代測(cè)序檢測(cè)
二代測(cè)序的建庫(kù)步驟②
二、片段化處理
物理方法:超聲破碎是常用的物理片段化方法。它通過(guò)超聲波的高頻振動(dòng)將核酸分子打斷成合適大小的片段。例如,在一些文庫(kù)構(gòu)建中,將DNA樣本置于超聲破碎儀中,通過(guò)調(diào)整超聲功率和時(shí)間,可以將DNA片段化到幾百堿基對(duì)(bp)的長(zhǎng)度范圍,一般在150-300bp左右,這符合二代測(cè)序的讀長(zhǎng)要求。超聲破碎的優(yōu)點(diǎn)是片段大小比較均勻,但操作需要優(yōu)化超聲參數(shù),否則可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)度破碎或片段大小不一致。
酶切方法:利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行片段化。限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別特定的DNA序列,并在這些序列處切割DNA。例如,用EcoRⅠ酶可以識(shí)別GAATTC序列并進(jìn)行切割。通過(guò)選擇合適的限制性內(nèi)切酶組合,可以將DNA切割成期望大小的片段。不過(guò),這種方法的局限性在于酶切位點(diǎn)的限制,可能無(wú)法獲得理想的片段大小分布,而且可能會(huì)引入酶切偏好性。 河北嘉安健達(dá)二代測(cè)序檢測(cè)二代測(cè)序讀長(zhǎng)方面比一代測(cè)序短很多。
二代測(cè)序的建庫(kù)步驟⑤
五、文庫(kù)富集(可選步驟)
PCR富集:對(duì)于一些起始樣本量較少或者連接效率較低的情況,可能需要進(jìn)行PCR富集。利用與接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,增加文庫(kù)中目標(biāo)DNA片段的數(shù)量。在PCR反應(yīng)中,需要注意引物的設(shè)計(jì)要與接頭序列準(zhǔn)確匹配,并且要優(yōu)化PCR循環(huán)數(shù),避免過(guò)度擴(kuò)增導(dǎo)致文庫(kù)多樣性降低或引入PCR偏差。一般會(huì)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的PCR循環(huán)數(shù),例如從10-15個(gè)循環(huán)開始嘗試,通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的量和質(zhì)量來(lái)調(diào)整循環(huán)數(shù)。
什么樣本可以做二代測(cè)序?①
1、血液樣本
全血:這是最常見的樣本類型之一。血液中含有白細(xì)胞,其細(xì)胞核內(nèi)有完整的基因組DNA。通過(guò)提取白細(xì)胞中的DNA,可以進(jìn)行全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序等。例如,在遺傳病的基因診斷中,抽取患者的全血,提取DNA后,對(duì)與疾病相關(guān)的基因或整個(gè)外顯子組進(jìn)行測(cè)序,以尋找致病突變。
血漿/血清:其中含有游離的DNA(cfDNA)和RNA(cfRNA)。在**患者中,腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放其DNA片段進(jìn)入血液循環(huán),這些cfDNA被稱為循環(huán)**DNA(ctDNA)。通過(guò)對(duì)血漿中的ctDNA進(jìn)行測(cè)序,可以實(shí)現(xiàn)**的早期篩查、***過(guò)程中的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等。例如,對(duì)于肺*患者,檢測(cè)血漿中的ctDNA來(lái)追蹤**的基因突變情況,為靶向***提供依據(jù)。 基因組重測(cè)序是二代測(cè)序嗎?
二代測(cè)序技術(shù)的一些***研究進(jìn)展③
技術(shù)優(yōu)化與創(chuàng)新領(lǐng)域
測(cè)序準(zhǔn)確性提高:通過(guò)改進(jìn)測(cè)序試劑、優(yōu)化測(cè)序反應(yīng)條件以及開發(fā)更先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析算法,二代測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性不斷提升,能夠更可靠地檢測(cè)到低頻變異和復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異等。
成本進(jìn)一步降低:隨著技術(shù)的不斷成熟和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的加劇,二代測(cè)序的成本持續(xù)下降,使得更多的研究機(jī)構(gòu)和臨床實(shí)驗(yàn)室能夠廣泛應(yīng)用該技術(shù),推動(dòng)了基因組學(xué)研究和臨床診斷的發(fā)展。
法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域
遺傳標(biāo)記檢測(cè):現(xiàn)有的二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)能夠完成 STR 遺傳標(biāo)記、SNP 遺傳標(biāo)記、mtDNA 及 mRNA 等遺傳標(biāo)記的測(cè)序,為法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別、親緣關(guān)系鑒定等提供了更豐富、準(zhǔn)確的遺傳信息。
技術(shù)應(yīng)用挑戰(zhàn)與應(yīng)對(duì):測(cè)序試劑盒中部分遺傳標(biāo)記的優(yōu)化、針對(duì)中國(guó)人群測(cè)序需求的試劑盒開發(fā)、數(shù)據(jù)采信標(biāo)準(zhǔn)的制定、測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件的優(yōu)化以及與現(xiàn)有法醫(yī)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的對(duì)接等,是二代測(cè)序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵,相關(guān)研究正在不斷推進(jìn)以解決這些問(wèn)題 。 單細(xì)胞測(cè)序也是二代測(cè)序。寧夏二代測(cè)序檢測(cè)
NGS測(cè)序是二代測(cè)序嗎?河北嘉安健達(dá)二代測(cè)序檢測(cè)
二代測(cè)序——RNA甲基化的概念、作用和檢測(cè)方法
RNA 甲基化概念及位置:RNA 甲基化是在 RNA 分子上添加甲基基團(tuán),其中 N6 - 甲基腺苷(m6A)是最常見的一種 RNA 甲基化修飾形式,它主要發(fā)生在 mRNA(信使 RNA)的腺嘌呤(A)殘基上。
作用
1、影響 RNA 的穩(wěn)定性:m6A 修飾可以影響 mRNA 的穩(wěn)定性。例如,一些帶有 m6A 修飾的 mRNA 更容易被降解,從而調(diào)控基因表達(dá)的時(shí)間和水平。2、調(diào)節(jié) RNA 的剪接和翻譯:m6A 修飾還能夠調(diào)節(jié) mRNA 的剪接過(guò)程,影響不同轉(zhuǎn)錄本的生成。同時(shí),它也可以在翻譯水平上發(fā)揮作用,影響蛋白質(zhì)合成的效率。
檢測(cè)方法
甲基化 RNA 免疫沉淀測(cè)序(MeRIP - Seq):這種方法主要是利用特異性識(shí)別 m6A 修飾的抗體,對(duì) RNA 進(jìn)行免疫沉淀富集,然后通過(guò)高通量測(cè)序來(lái)鑒定 m6A 修飾的位點(diǎn)和水平。 河北嘉安健達(dá)二代測(cè)序檢測(cè)