二代測序——轉(zhuǎn)錄組測序的實驗流程（下）

測序

根據(jù)研究需求和預算選擇合適的測序平臺，如 Illumina 測序平臺。它的測序原理主要是邊合成邊測序（SBS）。在測序過程中，dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）帶有不同顏色的熒光標記，當新的 dNTP 加入到正在合成的 DNA 鏈時，通過檢測熒光信號來確定堿基類型，從而讀取 cDN**段的序列。測序深度（覆蓋度）也是一個重要參數(shù)，一般來說，測序深度越高，檢測到的低表達轉(zhuǎn)錄本的概率就越大，但成本也會相應(yīng)增加。

數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)質(zhì)量控制是第一步，要去除低質(zhì)量的 reads（如含有較多不確定堿基 “N” 的 reads）和接頭序列。然后將高質(zhì)量的 reads 比對到參考基因組或轉(zhuǎn)錄組上，常用的比對軟件有 TopHat、STAR 等。在確定了 reads 的位置后，就可以計算轉(zhuǎn)錄本的表達量，常用的方法有 RPKM（Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）、FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments）等。此外，還可以進行差異表達分析，找出在不同樣本條件下（如疾病組和健康組）表達量有***差異的轉(zhuǎn)錄本，用于后續(xù)的功能注釋和通路分析，了解這些轉(zhuǎn)錄本可能參與的生物學過程和信號通路。 二代測序使用的是哪種設(shè)備？云南二代測序檢測

二代測序的操作流程有哪些？

1.DNA提取與質(zhì)檢

· 純凈、足量、質(zhì)量好的樣本DNA是檢測成功的基礎(chǔ)（可以來源于血漿、新鮮組織等）

2.DNA處理→文庫構(gòu)建

· 得到統(tǒng)一長度區(qū)間+有接頭的DNA片段

· 步驟：DNA打斷→末端修復→片段篩選→加A尾→接頭連接→PCR

3.靶向捕獲

· 特定區(qū)域基因的定向檢測

4.上機測序

· 根據(jù)通量情況選擇測序儀

· 上樣后機器完成

5.數(shù)據(jù)分析

· 初級分析：光強數(shù)據(jù)（不同熒光標記堿基）→序列信息（AGCT）

· 二級分析 多儀器自帶

· 三級分析 vcf文件 可diy 廣西哪里有二代測序提供高通量測序是二代測序嗎？

一代、二代、三代測序的區(qū)別分別是什么？

一代測序是上世紀70年代由Sanger和Coulson開創(chuàng)的DNA雙脫氧鏈終止法測序，也稱為Sanger測序。

二代測序技術(shù)(NGS)是為了改進一代測序通量過低的問題而出現(xiàn)的，能夠同時對上百萬甚至數(shù)十億個DNA分子進行測序?qū)崿F(xiàn)了大規(guī)模、高通量測序的目標。

三代測序主要有兩種技術(shù)PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore 的納米孔單分子測序技術(shù)，這兩種技術(shù)的測序讀長都可以達到幾-kb的級別，遠遠高于二代測序技術(shù)。

關(guān)于二代測序的簡介：

二代測序技術(shù)(Next-Generation Seguencing,NGS)也稱為高通量測序技術(shù)，是一種能夠同時對數(shù)百萬甚至數(shù)十億個 DNA片段進行測序的方法。與傳統(tǒng)的桑格測序相比二代測序技術(shù)具有高通量、高準確性、高靈敏度和低成本等優(yōu)勢。

二代測序技術(shù)在大幅提高了測序速度的同時，大幅度的降低了測序成本，保持了高準確性，以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間，而使用二代測序技術(shù)則需要1周，但其序列讀長方面比起一代測序技術(shù)則要短很多，大多只100bp-150bp。

基因組重測序是二代測序嗎？

二代測序——應(yīng)用領(lǐng)域類問題

二代測序在**研究中的應(yīng)用有哪些：可用于**的早期篩查，通過檢測血液中的循環(huán)**DNA；進行**的診斷分型，確定**的基因突變特征；評估***效果，監(jiān)測***過程中腫瘤細胞的基因變化；預測**的預后，分析與預后相關(guān)的基因標志物；還可用于尋找**的新靶點，為靶向***藥物的研發(fā)提供依據(jù)。二代測序在遺傳病診斷中的優(yōu)勢和局限性：優(yōu)勢在于能夠快速、***地檢測基因組中的變異，包括單核苷酸變異、小插入缺失、拷貝數(shù)變異等，提高了遺傳病的診斷率。局限性在于對于復雜基因組區(qū)域的檢測可能存在困難，如高度重復序列區(qū)域；檢測到的變異需要進一步的功能驗證和臨床解讀，部分變異的致病性難以確定；此外，成本相對較高，對于一些罕見病的診斷，可能需要較大的樣本量和更深入的分析。 二代測序廣泛應(yīng)用于基因組學研究。廣西二代測序

二代測序可以邊合成邊測序嗎？云南二代測序檢測

③二代測序一般多久出結(jié)果？

3、測序深度和覆蓋度要求

測序深度是指每個堿基被測序的平均次數(shù)，覆蓋度是指測序獲得的堿基占整個基因組（或目標區(qū)域）的比例。如果要求高測序深度和高覆蓋度，比如進行**全基因組的深度測序（測序深度可能達到100X甚至更高），需要更長的測序時間來獲取足夠的數(shù)據(jù)，并且后續(xù)的數(shù)據(jù)處理和分析也會更復雜。而對于一些簡單的基因篩查項目，測序深度要求較低（如10X-20X），相應(yīng)的測序和分析時間會縮短。例如，低深度全外顯子測序用于篩查常見突變，測序可能在3-5天完成；而高深度的全外顯子測序用于檢測低頻體細胞突變，可能需要7-10天甚至更久。 云南二代測序檢測

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