什么樣本可以做二代測(cè)序？③

細(xì)胞樣本

培養(yǎng)細(xì)胞：包括各種原代培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞系。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序可以了解細(xì)胞的基因特征和功能變化。例如，在研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時(shí)，對(duì)經(jīng)過特定刺激處理的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以分析基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)情況。

脫落細(xì)胞：如痰液中的脫落細(xì)胞、尿液中的脫落細(xì)胞等。這些細(xì)胞可以用于某些疾病的篩查。例如，在肺*篩查中，對(duì)痰液中的脫落細(xì)胞進(jìn)行基因檢測(cè)，通過二代測(cè)序?qū)ふ曳?相關(guān)的基因突變，作為一種非侵入性的檢測(cè)方法。 二代測(cè)序即高通量測(cè)序技術(shù)。山東嘉安健達(dá)二代測(cè)序

二代測(cè)序技術(shù)在不同人群中的準(zhǔn)確性有何差異②

遺傳病患者及攜帶者

優(yōu)勢(shì)：在常見單基因遺傳病如囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞貧血等的檢測(cè)中，二代測(cè)序技術(shù)準(zhǔn)確性高，能夠快速、準(zhǔn)確地找到致病基因，對(duì)于有家族遺傳病史的人群，可有效確定是否攜帶致病基因，評(píng)估生育患病后代的風(fēng)險(xiǎn)。

局限性：對(duì)于罕見遺傳病，由于基因突變的多樣性和復(fù)雜性，可能存在部分致病基因未被覆蓋或難以準(zhǔn)確解讀的情況，導(dǎo)致準(zhǔn)確性有所降低。此外，即使檢測(cè)結(jié)果為陰性，也不能完全排除患病可能，因部分遺傳病可能由未知基因突變或基因與環(huán)境相互作用引起2 吉林嘉安健達(dá)二代測(cè)序應(yīng)用二代測(cè)序是一種能夠同時(shí)對(duì)數(shù)百萬甚至數(shù)十個(gè)億DNA片段進(jìn)行測(cè)序的方法。

二代測(cè)序——甲基化的定義和概念

定義：甲基化（methylation）是指從活性甲基化合物（如S-腺苷基甲硫氨酸）上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過程。在生物系統(tǒng)中，這是一種常見的化學(xué)修飾方式，主要涉及在DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子上添加甲基基團(tuán)。

DNA甲基化

概念及位置：DNA甲基化主要是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的作用下，將甲基基團(tuán)添加到DNA分子中的特定堿基上，最常見的是在CpG島（富含CpG二核苷酸的區(qū)域，CpG是指胞嘧啶-鳥嘌呤的堿基對(duì)）的胞嘧啶（C）的5’碳位上添加甲基。

二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程（上）

樣本采集和 RNA 提取

樣本采集需要考慮研究目的和樣本類型。例如，研究**組織的轉(zhuǎn)錄組，就要準(zhǔn)確獲取**組織樣本，同時(shí)比較好有對(duì)應(yīng)的正常組織作為對(duì)照。RNA 提取方法有多種，常用的如 Trizol 法，它可以有效地從細(xì)胞或組織中提取總 RNA，包括 mRNA、rRNA 和 tRNA 等。提取后的 RNA 質(zhì)量至關(guān)重要，需要通過瓊脂糖凝膠電泳或?qū)ｉT的 RNA 質(zhì)量檢測(cè)儀器來評(píng)估 RNA 的完整性和純度。

RNA 質(zhì)量檢測(cè)和定量

完整性方面，通常使用 RNA 完整性指數(shù)（RIN）來衡量。RIN 值越高（一般認(rèn)為 RIN > 7 是高質(zhì)量 RNA），說明 RNA 完整性越好。定量方法主要有紫外分光光度法和熒光定量法。紫外分光光度法可以通過測(cè)量 RNA 在 260nm 和 280nm 處的吸光度比值來估計(jì) RNA 純度，比值在 1.8 - 2.0 之間表示純度較好。熒光定量法則是使用專門的熒光染料（如 Qubit）來更準(zhǔn)確地測(cè)量 RNA 濃度。

文庫構(gòu)建

首先要進(jìn)行mRNA富集，一般使用帶有poly-T的磁珠來特異性地捕獲mRNA，因?yàn)檎婧松飉RNA的3'端都有poly-A尾巴。然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過超聲或酶切等方法將cDNA片段化，片段大小通常在幾百個(gè)堿基對(duì)左右。之后在片段兩端連接上測(cè)序接頭，經(jīng)過PCR擴(kuò)增來增加文庫的量，使其達(dá)到可以上機(jī)測(cè)序的要求。

宏基因組測(cè)序是二代測(cè)序嗎？

二代測(cè)序——基因組測(cè)序該測(cè)幾個(gè)G？

1、人類全基因組測(cè)序

常規(guī)全基因組測(cè)序：一般建議測(cè)序深度為30X-50X，人類基因組大小約為3G，因此數(shù)據(jù)量通常在90G-150G左右。這樣的測(cè)序深度可以較為***地檢測(cè)到基因組中的各種變異，包括單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入缺失（Indel）、結(jié)構(gòu)變異（SV）等，適用于大多數(shù)疾病研究、群體遺傳學(xué)研究以及個(gè)體遺傳特征分析等。

高深度全基因組測(cè)序：對(duì)于一些特殊的研究目的，如檢測(cè)低頻變異、體細(xì)胞突變等，可能需要更高的測(cè)序深度，達(dá)到100X甚至更高。此時(shí)數(shù)據(jù)量會(huì)相應(yīng)增加到300G及以上，這種高深度測(cè)序能夠更靈敏地發(fā)現(xiàn)罕見的遺傳變異，但成本也會(huì)大幅提高。 二代測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是高通量。廣東二代測(cè)序應(yīng)用

一代、二代、三代測(cè)序的區(qū)別是什么？山東嘉安健達(dá)二代測(cè)序

二代測(cè)序——甲基化的作用和檢測(cè)方法有哪些？

作用

基因表達(dá)調(diào)控：DNA 甲基化通常與基因沉默有關(guān)。例如，在**發(fā)生過程中，某些抑*基因的啟動(dòng)子區(qū)域（調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄起始的 DNA 序列）可能會(huì)發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致這些基因無法正常表達(dá)，從而失去對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

發(fā)育調(diào)控：在胚胎發(fā)育過程中，DNA 甲基化模式的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于細(xì)胞分化和組織***形成至關(guān)重要。不同的細(xì)胞類型具有特定的 DNA 甲基化圖譜，這些圖譜引導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向分化。

檢測(cè)方法

亞硫酸鹽測(cè)序法：這是一種能夠精確檢測(cè) DNA 甲基化狀態(tài)的方法。其原理是利用亞硫酸鹽處理 DNA，未甲基化的胞嘧啶會(huì)被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持不變。經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序后，可以區(qū)分甲基化和未甲基化的位點(diǎn)。 山東嘉安健達(dá)二代測(cè)序

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