二代測(cè)序——蛋白質(zhì)甲基化

概念及位置：蛋白質(zhì)甲基化是指在蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上添加甲基基團(tuán)。常見(jiàn)的甲基化修飾位點(diǎn)包括精氨酸（Arg）和賴(lài)氨酸（Lys）殘基。

作用

1、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用：例如，組蛋白（染色體的組成成分）的甲基化可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，影響基因的可及性。當(dāng)組蛋白 H3 的賴(lài)氨酸殘基（如 H3K4、H3K9 等）發(fā)生甲基化時(shí)，會(huì)招募不同的蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而***或抑制基因轉(zhuǎn)錄。2、調(diào)節(jié)酶的活性：某些酶的活性可以通過(guò)蛋白質(zhì)甲基化來(lái)調(diào)節(jié)。甲基化可能改變酶的活性中心的結(jié)構(gòu)或者影響其與底物的結(jié)合能力。

檢測(cè)方法：質(zhì)譜分析：這是一種***用于檢測(cè)蛋白質(zhì)甲基化的方法。它能夠精確地確定蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量，通過(guò)比較甲基化和未甲基化蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖，可以鑒定甲基化位點(diǎn)和修飾程度。 宏基因組測(cè)序也是二代測(cè)序。甘肅哪里有二代測(cè)序提供

二代測(cè)序——甲基化的定義和概念

定義：甲基化（methylation）是指從活性甲基化合物（如S-腺苷基甲硫氨酸）上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過(guò)程。在生物系統(tǒng)中，這是一種常見(jiàn)的化學(xué)修飾方式，主要涉及在DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子上添加甲基基團(tuán)。

DNA甲基化

概念及位置：DNA甲基化主要是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的作用下，將甲基基團(tuán)添加到DNA分子中的特定堿基上，最常見(jiàn)的是在CpG島（富含CpG二核苷酸的區(qū)域，CpG是指胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤的堿基對(duì)）的胞嘧啶（C）的5’碳位上添加甲基。 湖南哪里有二代測(cè)序應(yīng)用二代和三代測(cè)序的區(qū)別？

一代、二代、三代測(cè)序的技術(shù)原理和技術(shù)特點(diǎn)分別是什么？

技術(shù)原理：

一代—雙脫氧終止法

二代—橋式PCR+4色熒光可逆終止+激光掃描成像

三代—PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)

技術(shù)特點(diǎn)：

一代—只能檢測(cè)序列一致的PCR產(chǎn)物；讀長(zhǎng)可以較長(zhǎng)，比如Sanger可以達(dá)到幾百bp；通量低，一次只能檢測(cè)少量的序列；成本低；

二代—可以并行測(cè)序；需要放大信號(hào)才能檢測(cè)；通量大，可以產(chǎn)生上G的reads；讀長(zhǎng)較短，一-般是固定的，比如50、100、150、250等；成本較高

三代：可以并行測(cè)序；不需要放大信號(hào)，對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行測(cè)序；通量大，比如SequelII平臺(tái)，一張芯片可以有800萬(wàn)個(gè)ZMW；讀長(zhǎng)較長(zhǎng)；測(cè)序精確度較差；成本高；

二代測(cè)序——技術(shù)原理類(lèi)問(wèn)題

二代測(cè)序與一代測(cè)序的區(qū)別是什么：一代測(cè)序技術(shù)如Sanger測(cè)序，一次只能讀取一條DNA序列，通量低、速度慢、成本高，但準(zhǔn)確性高，適用于對(duì)少量基因片段的精確測(cè)序。而二代測(cè)序技術(shù)具有高通量、速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可以同時(shí)對(duì)大量DNA分子進(jìn)行測(cè)序，但在單個(gè)堿基的準(zhǔn)確性上稍低于一代測(cè)序，二者在不同的應(yīng)用場(chǎng)景中各有優(yōu)勢(shì)。二代測(cè)序有哪些主要的測(cè)序原理：主要包括邊合成邊測(cè)序和連接法測(cè)序。邊合成邊測(cè)序是在DNA聚合酶的作用下，逐個(gè)添加帶有熒光標(biāo)記的dNTP，通過(guò)檢測(cè)釋放的熒光信號(hào)來(lái)確定堿基序列；連接法測(cè)序則是利用DNA連接酶將寡核苷酸探針連接到模板DNA上，根據(jù)連接的探針序列來(lái)推斷模板DNA的堿基組成。 二代測(cè)序可以檢測(cè)基因嗎？

④二代測(cè)序一般多久出結(jié)果？

4、數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜程度

數(shù)據(jù)分析是二代測(cè)序的重要環(huán)節(jié)。簡(jiǎn)單的分析，如檢測(cè)已知的單核苷酸多態(tài)性（SNP），可以通過(guò)與參考基因組比對(duì)后利用一些成熟的軟件快速完成。但如果是進(jìn)行復(fù)雜的分析，如尋找新的基因融合事件、復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)或者進(jìn)行從頭組裝（denovoassembly），則需要更復(fù)雜的算法和更多的計(jì)算資源，花費(fèi)的時(shí)間可能從數(shù)天到數(shù)周。例如，對(duì)于常規(guī)的SNP檢測(cè)和注釋?zhuān)瑪?shù)據(jù)分析可能在1-3天內(nèi)完成；而對(duì)于**樣本中復(fù)雜的基因融合分析，可能需要3-7天甚至更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。 二代測(cè)序通量大，可以產(chǎn)生上G的reads.江西嘉安健達(dá)二代測(cè)序技術(shù)

二代測(cè)序的過(guò)程有哪些？甘肅哪里有二代測(cè)序提供

二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程（上）

樣本采集和 RNA 提取

樣本采集需要考慮研究目的和樣本類(lèi)型。例如，研究**組織的轉(zhuǎn)錄組，就要準(zhǔn)確獲取**組織樣本，同時(shí)比較好有對(duì)應(yīng)的正常組織作為對(duì)照。RNA 提取方法有多種，常用的如 Trizol 法，它可以有效地從細(xì)胞或組織中提取總 RNA，包括 mRNA、rRNA 和 tRNA 等。提取后的 RNA 質(zhì)量至關(guān)重要，需要通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或?qū)ｉT(mén)的 RNA 質(zhì)量檢測(cè)儀器來(lái)評(píng)估 RNA 的完整性和純度。

RNA 質(zhì)量檢測(cè)和定量

完整性方面，通常使用 RNA 完整性指數(shù)（RIN）來(lái)衡量。RIN 值越高（一般認(rèn)為 RIN > 7 是高質(zhì)量 RNA），說(shuō)明 RNA 完整性越好。定量方法主要有紫外分光光度法和熒光定量法。紫外分光光度法可以通過(guò)測(cè)量 RNA 在 260nm 和 280nm 處的吸光度比值來(lái)估計(jì) RNA 純度，比值在 1.8 - 2.0 之間表示純度較好。熒光定量法則是使用專(zhuān)門(mén)的熒光染料（如 Qubit）來(lái)更準(zhǔn)確地測(cè)量 RNA 濃度。

文庫(kù)構(gòu)建

首先要進(jìn)行mRNA富集，一般使用帶有poly-T的磁珠來(lái)特異性地捕獲mRNA，因?yàn)檎婧松飉RNA的3'端都有poly-A尾巴。然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過(guò)超聲或酶切等方法將cDNA片段化，片段大小通常在幾百個(gè)堿基對(duì)左右。之后在片段兩端連接上測(cè)序接頭，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)增加文庫(kù)的量，使其達(dá)到可以上機(jī)測(cè)序的要求。

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